黄芩药材的毛细管电泳指纹图谱研究

王丽聪，曹玉华

（1.江阴职业技术学院化纺系，江苏 江阴 214431；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214036）

黄芩药材的毛细管电泳指纹图谱研究

王丽聪1，曹玉华2

（1.江阴职业技术学院化纺系，江苏 江阴 214431；2.江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214036）

采用毛细管电泳方法建立黄芩不同产地药材的指纹图谱。考查多种提取方法提取黄芩药材中黄芩苷的提取率；研究运行缓冲液的浓度和酸度、检测波长及分离电压对黄芩药材指纹图谱的影响，得到了优化的测定条件（50mmol/L硼砂缓冲液，pH值7.94，分离电压为20kV,柱上254nm紫外检测）。进行精密度和重现性实验，各共有峰相对峰面积和相对保留时间的RSD均小于5%。最后利用相似度和聚类分析两种方法对10批黄芩药材的毛细管电泳指纹图谱进行分析，结果与实际样品分类相符合。

毛细管电泳；指纹图谱；黄芩

目前，色谱法尤其是高效液相色谱法（HPLC）是中药指纹图谱研究最常用方法。但用HPLC进行中药成分分析常遇到一些问题。如色谱柱易受污染，柱寿命短且难以再生，分析运行成本高且费时长。毛细管电泳具有分离效率高、分析速度快、试剂用量少和成本低等优点[1，2]，运用高效毛细管电泳（HPCE）方法对黄芩药材的指纹图谱进行研究，作者还未见报道。本研究运用HPCE方法建立黄芩药材指纹图谱，并对10批药材的指纹图谱进行了分析比较，为黄芩药材的质量评估提供了一定的科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效毛细管电泳系统(CAPEL 105,俄罗斯),配有紫外检测器；超声波振荡器(BRANSON SB3200-T,上海)；微波炉（松下变频）；石英毛细管(有效长度: 52 cm,内径:50μm,Polymicro Technologies,USA)。HW-2000色谱工作站（上海千谱软件有限公司，上海）。

所用药材样品山西黄芩（1#）、内蒙黄芩（2#）、滇黄芩（家种3#）、滇黄芩（野生4#）均由洛阳高新开发区陆生天然植物研究所王忠东教授提供并鉴定，其余河北黄芩5-10#为市售。所用试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 供试品溶液的制备

精确称取黄芩粉末试样约0．1g，加入水10mL，微波提取40s，离心，吸取上层清夜，经0．45μm滤膜过滤，即得黄芩样品溶液。

1.3 实验方法

运行缓冲液为50mmol/L的硼砂缓冲溶液（pH= 7．94），所有溶液使用前均用0．45μm聚丙稀滤膜过滤，测定温度20℃，分离电压20kV，检测波长254nm，30 mb压力进样，进样时间10s。实验前，依次用0．1mol/L的NaOH、水、运行缓冲液分别冲洗10、4、20min，两次进样间用缓冲液在20kV电压下冲洗5min。

2 结果与讨论

2.1 样品溶液的制备

实验中曾采用各种提取方法，包括：不同比例醇提、水提、超声醇提、超声水提及微波提取。黄芩苷含量一般作为黄芩药材的质量控制指标。以考查各种提取方法的提取率，将提取液中黄芩苷的含量作为选择提取方法依据之一,结果如表1所示（表中方法1～4依次表示25%，50%，75%，100%乙醇超声波提取30min；方法5为水煎煮30min；方法6为水超声波提取30min；方法7～10表示依次25%，50%，75%，100%乙醇回流提取30min；方法11为微波提取40s）。结果可知，微波提取40s与75%乙醇回流提取30min所得黄芩苷的提取率最高。其次,根据指纹图谱的特性，我们考察各种提取方法所得电泳图中峰的个数，发现各谱图中峰个数依次为微波提取40s＞75%乙醇回流提取30min＞水煎煮30min＞水超声波提取30min＞乙醇超声波提取30min。综合以上两点的考察,我们确定微波提取40s为黄芩毛细管电泳指纹图谱的最佳提取方法。同时，微波提取还具有简便、省时等优点。

表1 不同提取方法所得黄芩苷含量

2.2 电泳条件

由于硼砂与黄酮类化合物发生螯合反应可以增大被测组分的溶解度，所以选择硼砂溶液作为缓冲液。运行缓冲液的pH值是影响电渗流和各分离组分电泳淌度的最重要因素。考查了pH值6～10范围对电泳分离的影响发现，当pH值大于8．5时，图（1）中前两个大峰均为混合峰，没有得到分离；且pH值越高，黄酮类物质越易氧化，测定的重现性不能得到保证。当pH值小于7．7时，图(2)中最大的峰为混合峰，没有得到分离。而pH值在7．7～8．2之间，各峰基本分离，见图（3）。因此，选择pH值7．94为最佳运行缓冲液pH值。此外，还考察了不同检测波长（210，254，278，290nm）及不同分离电压（15、20、25kV）的影响。从灵敏度、分离度以及电泳峰个数综合考虑，选择254nm作为检测波长，以50mmol/L硼砂（pH=7．94）为运行缓冲液，分离电压20kV，30mBar下压力进样10s的最佳电泳条件。

2.3 指纹图谱的建立

不同样品按照1．3方法分别进样，测定，得各样品的毛细管电泳指纹图谱。黄芩样品的典型电泳图见图3。

2.4 方法学考察

仪器精密度实验：取同一供试品溶液，连续进样5次，测得共有峰11个，各色谱峰相对保留时间的RSD＜3%，共有峰相对面积的RSD＜5%，表明仪器精密度良好。

重现性实验：取同一样品5份，按1．2条方法制备供试品溶液，分别进样，测得各色谱峰相对保留时间RSD＜4%，共有峰相对面积的RSD＜5%，表明方法重现性良好。

稳定性实验：取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24h进样，各色谱峰相对保留时间的RSD＜5%，色谱峰相对峰面积的RSD＜5%，表明供试品溶液在24h之内稳定。

2.5 指纹图谱各项技术参数

2.5.1 相似度计算

采用工作站计算软件，对10批药材指纹图谱进行重叠，各批样品相应色谱峰大体重叠，符合匹配要求。匹配后产生11个共有电泳峰，以6号峰作为参照物，计算10批样品共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表2和表3。以供试品的各峰平均值为对照模板，利用Excel 2002软件[3]，采用夹角余弦和相关系数的方法来计算黄芩指纹图谱相对保留时间和相对峰面积的相似度。结果如表3和表4中第12、13行所示。

表2 样品的CE指纹图谱色谱峰的相对保留时间

表3 样品CE指纹图谱色谱峰相对面积值

2.5.2 系统聚类分析

各色谱峰的相对峰面积值见表3，以相对峰面积值为变量，利用SAS软件中最小距离法进行聚类分析，结果将10个样品分为五类，如图4所示。

2.5.3 结果分析

相似度计算结果表明,5个产地黄芩药材的指纹图谱的图貌基本一致,但各共有峰的相对峰面积有所不同。从表3可以看出，除了3＃～4＃滇黄芩外其他样品的指纹图谱的相似系数均大于0．985，即滇黄芩与其他样品间的差异较明显，5#～10#为相同产地，样品指纹图谱的相似系数没有明显差异。聚类分析树形图表明，10批样品分为5类，5#～10#为最小距离，分为一类，而1#～4#各分为一类，这与事实相符合。这些都表明黄芩中各成分含量的差异与其生长环境密切相关，不同产地，峰面积比值有较大差异。因此，本研究结果从一定程度上表明指纹图谱是控制药材内在质量的有效手段。

［1］ 曹玉华，汪云．毛细管电泳电化学检测法测定胡黄连中香草酸和阿魏酸的含量[J]．分析测试学报,2003,22(6):95-97．

［2］ 刘保启，胡孝忠，王玉春，等．高效毛细管电泳法测定姜黄中姜黄素类化合物[J]．分析测试学报,2004，23(1):109-111．

［3］ 苗爱东，孙殿甲．Excel 2002在中药指纹相似度计算中的应用[J]．药学进展,2003,27(1):51-54

Study on the fingerprints of radix scutelariae by HPCE

WANG Li-cong1,CAO Yu-hua2
(1.Department of Chemical Engineering,Jiangyin Polytechnic College,Jiangsu Jiangyin,214431; 2.School of Chemical and Material Engineering,Southern Yangtze University,Jiangsu Wuxi 214036)

A method based on high performance capillary electrophoresis(HPCE)to establish the fingerprint of Radix Scutelariae was described.The contents of Baicalin in Radix Scutelariae extraction with various kinds of extraction methods were determined to choose appropriate extraction method.The effects of concentration and acidity of running buffer,UV detection wavelength and applied voltage were investigated.The optimum conditions were a 50mmol/L borax buffer(pH7.94)as the running buffer,separation voltage of 20kV and 254nm as detection wavelength.This proposed method demonstrated good stability and reproducibility with RSD less than 5%for both the relative retention time and the relative areas.Finally,the data of fingerprints of 10 batches of Radix Scutelariae were processed with two different mathematic methods of similitude coefficient and the SAS system,and the results of both methods were consistent with the facts.

capillary zone electrophoresis;radix scutelariae;fingerprints

book=2010,ebook=185

10.3969/j.issn.1008-1267.2010.04.009

TQ657.8

A

1008-1267（2010）04-024-04

2010-03-10

王丽聪（1979-），女，山西汾阳人，硕士，研究方向为中药分析。