褪黑素对脂多糖刺激小鼠体内炎症反应

代国杰, 朱建津, 高琳琳, 单立娟

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

褪黑素对脂多糖刺激小鼠体内炎症反应

代国杰, 朱建津＊, 高琳琳, 单立娟

(江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

研究脂多糖(LPS)刺激时,褪黑素对小鼠炎症反应的影响。用脂多糖建立炎症反应模型,检测肝脏中白介素-1(IL-1)、白介素-10(IL-10)水平,血清中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)以及小肠髓过氧化物酶(MPO)的活性变化。在LPS刺激后4 h时,灌胃褪黑素的小鼠IL-1和小肠MPO明显低于灌胃生理盐水组和正常组,而IL-10高于灌胃生理盐水组和正常组,刺激后16 h时,IL-1、IL-10和MPO均较刺激后4 h有所降低。褪黑素对LPS所诱导的炎症反应有明显的抑制作用,有助于维持机体炎症/抗炎症平衡,保护机体免受炎症损伤。

褪黑素;LPS;IL-1;IL-10;MPO

褪黑素(Melatonin,MT)是主要由哺乳动物和人类的松果体在夜间分泌的一种吲哚胺类激素,化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺[1]。1958年Lerner首先从牛的松果体中分离得到该物质,经提纯后可以使两栖类动物的皮肤变白,因此命名为褪黑素。它有着调节昼夜节律、睡眠、内分泌等多种重要生理功能的作用。人们在发现其强大的抗氧化作用后,逐渐发现褪黑素尚具有显著抗炎能力。Martins等[2]证实褪黑素具有明显的抑制炎症细胞向肺部迁移浸润和减少肺泡灌洗液中炎症细胞数量等抗炎作用。Carrilb等[3]报道,在感染性休克大鼠模型中,通过腹腔注射MT可以提高抗炎因子IL-10的释放,降低TNF-α,IL-12浓度,增加其生存率。近来发现MT尚具有抑制炎症因子释放的抗炎作用[4]。本研究以脂多糖构建炎症模型,观察褪黑素对炎症因子的影响,以及对一氧化氮和一氧化氮合酶的调节作用,来探讨其抗炎机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料和仪器

清洁级三周龄雄性昆明小鼠:体重(18～20)g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号: SOXK(沪)2007-0005;脂多糖:西安沃尔森生物技术有限公司产品;褪黑素,武汉远城科技发展有限公司,纯度99%;MPI-B型多参数化学发光检测仪:西安瑞迈分析仪器有限公司产品;MuLtiskan MK3酶标仪:美国Thermo公司产品;UV1100型紫外可见分光光度计:北京瑞利科学仪器有限公司产品。

1.2 实验动物与设计

采用3周龄昆明种断奶小鼠70只,按体重随机平均分成4组:对照组、生理盐水组(简称S组,又分成LPS 4 h组和LPS 16 h组)、低褪黑素组(简称LMT组,又分为LPS 4h组和LPS 16 h组)、高褪黑素组(简称HMT组,又分为LPS 4 h组和LPS 16 h组),生理盐水组每天灌胃生理盐水0.2 mL;低褪黑素组每天灌胃1 mg/kg体重的褪黑素0.2 mL;高褪黑素组每天灌胃2 mg/kg体重的褪黑素0.2 mL。灌胃3周后,S组、LMT组、HMT组灌胃LPS,对照组灌胃同剂量的无菌生理盐水,灌胃后4、16 h,取血液、肝脏、脾、小肠组织样,液氮保存,待测。

1.3 指标检测

采血,离心取上清;小肠、肝脏按重量体积比用冷的生理盐水制成组织匀浆(10%),待测;肝脏IL-1,IL-10,小肠MPO用南京建成试剂盒测定;一氧化氮(NO)的测定用硝酸还原酶法测定;一氧化氮合酶(NOS)的测定用化学比色法测定;蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。

1.4 数据分析

实验结果采用SPSS统计软件进行方差分析的多重比较。

2 结果与分析

2.1 褪黑素对LPS刺激小鼠肝脏IL-1和IL-10的影响

IL-1是前炎症细胞因子,为炎性反应启动物质,它作用于多种细胞,作为诱导细胞反应中的最初物质,在细胞和亚细胞水平激发一系列级联反应或“瀑布反应”,诱导IL-6等多种炎性因子的产生及发挥作用。IL-10作为抗炎介质对炎症免疫应答有抑制作用,有助于全身炎症反应的控制。它通过T辅助细胞下调宿主的反应,抑制促炎细胞因子TNF-α、IL-6等的过度表达,并且能控制由促炎因子引发的过度的炎症反应所造成的对机体的损害[5],并且对抗炎症物质如IL-1具有正向调节作用。

表1 褪黑素对小鼠肝脏IL-1和IL-10的影响(X±SD)Tab.1 Effect of Melatonin on serum NO under LPS stimulation(X±SD)

表1显示,小鼠在LPS刺激后4 h时,炎性细胞因子IL-1和抗炎性细胞因子IL-10的分泌显著增加(P<0.01);而灌胃褪黑素组的小鼠IL-1(P< 0.05)的分泌受到明显抑制,IL-10(P>0.05)的分泌增加。LPS刺激后16 h时,IL-1和IL-10的分泌相对于4 h时有所降低(P>0.05),灌胃高褪黑素组的要比低褪黑素组的效果好。以上结果表明,在LPS刺激后的第4、16 h,褪黑素均可使炎性细胞因子IL-1的分泌降低,抗炎性细胞因子IL-10的分泌增加,在刺激后4 h时表现更为明显。本实验结果显示,MT可以显著抑制炎性细胞因子IL-1的分泌,促进抗炎性细胞因子IL-10的分泌,这可能是由于MT从抑制NF-кB激活水平而下调炎性细胞因子的表达。

2.2 褪黑素对LPS刺激小鼠血清中NO含量和NOS活性的影响

NO是一种活性氮自由基,参与机体多种生理和病理过程,起着生理和毒理的双重作用,少量NO发挥调节心血管、神经传导及提高免疫的作用;大量的NO则会导致DNA损伤、抑制线粒体呼吸,并可与超氧阴离子作用,造成神经毒性、自身免疫性疾病等[6]。NOS是产生自由基的酶之一,可促进NO的合成,NO与过氧化硝酸盐结合产生自由基。目前认为,褪黑素影响NO的机制之一是抑制细胞膜上电压依赖性Ca2+通道,使细胞内Ca2+浓度减少,从而减少Ca2+/CaM复合物生成,抑制NOS,进而降低细胞内NO的合成[7]。实验结果见图1和表2。

图1显示,LPS刺激4 h,灌胃生理盐水的小鼠血清中NO含量(P<0.05)显著升高,而灌胃低褪黑素和高褪黑素的小鼠血清中NO含量(P<0.05)显著降低,并且后者将低得多。(P<0.05);16 h时,血清中NO含量相对第4 h时有所下降(P> 0.05),灌胃褪黑素组的小鼠血清中NO含量均低于同时间灌胃生理盐水小鼠血液中的含量,并且灌胃高剂量褪黑素组小鼠血液中NO含量(P<0.05)基本上能达到正常组小鼠水平。

图1 褪黑素对LPS刺激小鼠血清中NO含量的影响(X±SD)Fig.1 Effect of Melatonin on NO of serum under LPS stimulation(X±SD)

表2 褪黑素对LPS刺激小鼠血清中NOS活性的影响(X± SD)Tab.2 Effect of Melatonin on serum NOSactivity under LPS stimulation(X±SD)

表2显示,小鼠在LPS刺激4 h时,灌胃生理盐水的小鼠血清中NOS活性显著升高(P<0.05),而灌胃褪黑素组的小鼠血清中NOS活性有所降低(低褪黑素组P>0.05,高褪黑素组P<0.05);LPS刺激16 h时,NOS活性相对于4 h均有所降低,高褪黑素组(P<0.05)仍低于低褪黑素组(P> 0.05)。

2.3 褪黑素对LPS刺激小鼠小肠MPO的影响

中性粒细胞是炎性反应可溶性介质的来源,在炎症的发生过程中,一般都伴随着中性粒细胞的浸润。MPO是中性粒细胞嗜天青颗粒产生的一种重要的过氧化物酶,其含量的增高可以反映中性粒细胞在某一组织中的增高,间接反映炎症在组织中的存在。

图2 褪黑素对LPS刺激小鼠小肠MPO含量的影响(X±SD)Fig.2 Effect of Melatonin on duodenum MPO under LPS stimulation(X±SD)

图2显示,小鼠在受到LPS刺激第4 h时,小肠MPO活性显著升高(P<0.05),而灌胃褪黑素可以显著抑制小肠MPO活性升高(P<0.05)。第16 h时,MPO活性相对于4 h时显著降低(P< 0.05),高褪黑素组要优于低褪黑素组。

3 结 语

炎症是一种常见的病理过程,许多疾病与此有关。机体在正常情况下,由于不断地和少量的病原体遭遇,经常有炎性细胞和补体的活化以及炎症介质的生成,与此同时,机体不断地动员抗炎机制抑制这种活化,维持机体炎症/抗炎症平衡及其在体内自稳中的作用[8]。病原体以及其他致炎因子诱导炎症反应或者某些原因抑制了抗炎机制将使这一平衡失调,发生炎症。本研究以腹腔注射脂多糖构建炎症模型,探讨褪黑素的抗炎作用及其机制。

IL-1是影响炎症进程的主要细胞因子,是体内作用最强的炎症介质之一[9]。IL-10是对免疫应答起抑制作用的一种细胞因子,它能限制炎症过程的发展,且在内源性自身稳定上有作用,其机制可能是改变细胞内信号传导途径而选择性抑制有关细胞因子的合成[10]。本实验结果显示,LPS刺激后,诱导了炎性细胞因子IL-1的分泌,刺激了机体的炎症反应,灌胃褪黑素组小鼠的IL-1的分泌降低,而IL-10的分泌明显增加,这表明褪黑素有助于降低机体的炎症反应。LPS刺激16 h时,由于机体自身的调节作用,IL-1和IL-10的分泌比刺激后4 h时降低,褪黑素的抗炎性作用也没有4 h时明显。褪黑素对炎性细胞因子的调控作用目前还不完全清楚,有研究认为[11],褪黑素可以通过防止止NF-kB转移核内与DNA结合,降低前炎症细胞因子水平。

实验结果显示,在LPS刺激下,褪黑素能够降低NOS的活性,从而减少毒性NO的生成,减轻了细胞的损害,对细胞具有保护作用,其机制可能是褪黑素通过减少氧自由基和细胞因子的释放,从而抑制制NF-κB活化,后者则是。McCann等[12]发现NO可以激起松果体分泌MT增加,消除NO,减少NO神经毒性,MT尚能显著抑制NOS基因相关表达。亦有研究表明,褪黑素还可直接清除NO[13]。NOS是产生自由基的酶之一,可促进NO的合成, NO与过氧化硝酸盐结合产生自由基。有研究发现MT能通过钙调蛋白抑制体内NO合成的关键酶—一氧化氮合酶的活性,从而抑制体内NO的过度生成及其他活性氮(reactive nitrogen species,RNS)分子的产生,对损伤和炎症有拮抗作用。这与上述研究结果是相符合的。

MPO是中性粒细胞中的一种酶,其含量的增高可以反应中性粒细胞在某一组织中的增高,间接反映炎症在组织中的存在。本实验结果表明,LPS刺激后,灌胃褪黑素能明显的降低小肠MPO的含量,保护小肠的正常机能。

综上所述,机体在应激或受到外来刺激时,会打破自身炎症/抗炎症的动态平衡,而炎症反应的失控将对机体产生不利影响[14]。LPS刺激小鼠后,引起小鼠体内炎症反应,而灌胃褪黑素可以降低炎性细胞因子IL-1的分泌,促进抗炎性细胞因子IL-10的分泌,降低NOS的活性,从而减少毒性NO的生成,降低小肠MPO的含量,从而减轻机体的炎症损伤,证实了褪黑素具有一定的抗炎症作用,利于机体稳定的维持,从而表现出对机体的保护作用。

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(责任编辑:杨萌)

Effect of Melatonin on Inflammaofory and Anti-Inflammatory Balance of Mice

DAI Guo-jie, ZHU Jian-jin＊, GAO Lin-lin, SHAN Li-juan
(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In this study,the physiological parameters of melatonin live,including inflammatory cytokine IL-1,IL-10 of spleen,intestinal myeloperoxidase(MPO)were determined after LPS treat.It was found that content of IL-1 and MPO activity decreased but IL-10 increased after 4 h stimulation by LPS.For the case of 16 h,the values of IL-1,IL-10 and MPO activity were lower than that of 4 h.The results indicated melatonin can depress inflammation induced by LPS, maintain inflammatory and anti-inflammatory balance and protect animals from injury.

melatonin,lipopolysaccharide,interleukin 1,interleukin 10,myeloperoxidase(MPO)

Q 463;R 363.2

:A

1673-1689(2010)01-0040-04

2009-05-25

国家自然科学基金项目(30671525)。

＊通讯作者:朱建津(1966-),男,浙江丽水人,工学博士,副教授。主要从分子营养学研究。Email:zhujianjin179 @sina.com