法夫酵母产新科斯糖的发酵条件

宁亚维, 张静娟, 苏丁, 杨哪, 徐学明

(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡 214122;2.江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

法夫酵母产新科斯糖的发酵条件

宁亚维1,2, 张静娟2, 苏丁2, 杨哪2, 徐学明1,2

(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏无锡 214122;2.江南大学食品学院,江苏无锡 214122)

通过单因素实验及正交试验对法夫酵母摇床发酵产新科斯糖的培养基组成和培养条件进行优化,得出该菌株产新科斯糖的最佳发酵条件为:蔗糖110 g/L,玉米浆粉8 g/L,种龄48 h,接种体积分数10%,发酵周期24 h,初始p H 6.5,摇床转速220 r/min,发酵温度18℃。经优化后新科斯糖产量最高可达73.2 g/L,蔗糖利用率为66.5%,比优化前发酵效率提高了87.1%。

法夫酵母;新科斯糖;蔗糖;摇瓶发酵

蔗果低聚糖(Fructooligosaccharides,FOS),又称寡果糖或低聚果糖,广泛存在于天然水果和蔬菜中,不仅口感良好,而且具有优良的生理功能。它能促进肠道双歧杆菌增殖,调节肠道菌群平衡,改善和调节肠道功能,防治便秘和腹泻;另外,具有低能量或无能量、预防龋齿、降低血清胆固醇、降低血脂和血压等功效[1]。由此,FOS是一种国际上公认的功能性养生食品和新型糖源,在食品、饲料、医药、保健品等行业应用广泛[2]。目前工业上主要利用黑曲霉Aspergillus niger[3],青霉Penicillium citrinum[4],运动单胞菌Zymomonas mobilis[5],乳杆菌L actobacillus reutri[6]等来生产低聚果糖。由于大多数酵母所产的果糖苷酶具有很强的水解能力,最终又将合成的低聚果糖水解,导致低聚果糖产量甚少[7],因此目前对于酵母产低聚果糖的研究较少。

新科斯糖(neokestose)是一种蔗果三糖族低聚糖,由果糖基C-2与蔗糖分子中的葡萄糖基C-6位相连所得。它可由法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)发酵来生产。目前国内外对法夫酵母的研究主要集中于虾青素的发酵生产上,如高产虾青素菌株选育[8]、发酵工艺研究[9]、色素提取[10]、色素稳定性[11]及虾青素的功能特性[12]等,且已能实现规模化生产。而以法夫酵母为出发菌株,蔗糖为碳源进行发酵产新科斯糖的研究则鲜为报道,Kilian等人[13]发现法夫酵母在以蔗糖为碳源的培养基上生长时能积累新科斯糖,国内江南大学利用法夫酵母生产新科斯糖的方法已获国家发明专利授权[14],苏丁[15]对法夫酵母所产新科斯糖的结构进行了鉴定。作者主要就法夫酵母产新科斯糖的发酵条件进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菌株:法夫酵母269,作者所在实验室选育[8]。

培养基(g/L):种子培养基和发酵培养基见文献[14]。

主要试剂:新科斯糖标准品为作者所在实验室制备[15],蔗糖等其他试剂均为国产分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 种子培养 从斜面上挑一环菌,接入装有25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,22℃、220 r/min培养48 h作为种子液。

1.2.2 摇瓶发酵 将种子培养液以体积分数5%接入发酵培养基,摇床转速220 r/min,22℃发酵32 h。

1.2.3 分析方法

1)新科斯糖的测定:HPLC为岛津LC-20A。色谱柱为Waters Sugarpak1,6.5 mmid×300 mm;流动相为超纯水;流速为0.5 mL/min;检测器为示差折光检测器;进样体积为10μL。

2)生物量的测定:干重法测定[16]。

2 结果与讨论

2.1 发酵培养基的优化

2.1.1 蔗糖质量浓度对发酵生产新科斯糖的影响

碳源是构成菌体和合成新科斯糖的底物来源。通常作为碳源的物质,主要是各种糖类,淀粉等。根据文献[17]报道,碳源除了蔗糖外,葡萄糖、果糖、淀粉等均对果糖基转移酶活性不利。蔗糖既是酶作用的底物又是一种诱导物,故选择蔗糖作为发酵产糖的惟一碳源。

以5.22 g/L酵母膏为氮源,蔗糖质量浓度设置为70、90、110、130、150 g/L 5个水平进行比较,在22℃、220 r/min发酵32 h,结果见图1。

图1 蔗糖质量浓度对法夫酵母产糖的影响Fig.1 Effect of sucrose concentration on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

由图1可以看出,随着蔗糖质量浓度增加,新科斯糖质量浓度呈一定的上升趋势,但糖利用率随糖质量浓度的增加而降低。综合考虑所得新科斯糖产量和蔗糖转化率,选取蔗糖质量浓度为110 g/L进行摇瓶发酵。

2.1.2 氮源对发酵生产新科斯糖的影响 以110 g/L蔗糖为碳源,分别用等摩尔量的不同氮源取代酵母膏,在22℃、220 r/min下发酵32 h,结果见图2。

由图2可知,当利用玉米浆粉作为发酵氮源时,菌体生长较好且新科斯糖产量最高,这与徐学明[16]等的研究结果相一致。玉米浆粉(或玉米浆)能显著促进法夫酵母生长。玉米浆粉除含有丰富的可溶蛋白质、生长素等为菌体生长繁殖提供营养外,还可能含有果糖苷酶合成的前体物质。同时若采用玉米浆粉做氮源不仅有利于产物合成,而且还可在一定程度上降低发酵成本。因此作者选取玉米浆粉作为发酵培养基氮源。

图2 氮源对法夫酵母产糖的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

2.1.3 玉米浆粉质量浓度对发酵生产新科斯糖的影响 蔗糖110 g/L,配制玉米浆粉浓度分别为2、4、6、8、10 g/L的培养基,在22℃、220 r/min下发酵32 h后测定新科斯糖产量和生物量,结果见图3。

图3 玉米浆粉质量浓度对法夫酵母产糖的影响Fig.3 Effect of corn syrup powder concentration on the neokestoseproductionbyXanthophyllomyces dendrorhous

图3表明,适当提高玉米浆粉质量浓度可提高新科斯糖产量,但玉米浆粉质量浓度大于8 g/L时,由于氮源过多导致菌体生长过旺,使底物蔗糖过早耗尽,从而使得新科斯糖的合成受到抑制。

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 接种体积分数对法夫酵母产新科斯糖的影响 分别以体积分数2%、4%、6%、8%、10%、12%的接种量在25 mL/250 mL发酵培养基中接入种子液,32 h后测定其新科斯糖产量及生物量,结果见图4。

图4 接种体积分数对法夫酵母产糖的影响Fig.4 Effect of inoculum concentration on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

由图4可知,接种体积分数为10%时,新科斯糖产量最高。随着接种体积分数的增加,新科斯糖产量也随之增大,但当接种体积分数大于10%时,新科斯糖产量开始降低。这表明较大的接种体积分数可以缩短发酵周期,减少杂菌的生长机会;但接种体积分数过高则引起溶氧不足,最终导致新科斯糖产量降低。Chien[18]等在用固定化Aspergillus japonicus生产低聚果糖时也有类似的发现。

2.2.2 初始p H值对法夫酵母产新科斯糖的影响

蔗糖110 g/L,玉米浆粉为8 g/L,配制p H分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的培养基,22℃、220 r/min下发酵32 h后测定其新科斯糖产量及生物量,结果见图5。

初始p H值对法夫酵母产糖影响较大。p H值在5～8范围内时新科斯糖产量均较高。这一结果表明,法夫酵母所产果糖基转移酶的最适p H值接近中性,与kilian[19]的研究一致。

图5 初始pH值对法夫酵母产糖的影响Fig.5 Effect of initial pH on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

2.2.3 发酵温度对法夫酵母产新科斯糖的影响蔗糖110 g/L,玉米浆粉8 g/L,p H 6.0,温度分别设置为18、20、22、24、28、32℃,在220 r/min的转速下发酵32 h后测定新科斯糖产量及生物量。

图6 发酵温度对法夫酵母产糖的影响Fig.6 Effect of temperature on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

由图6可知,法夫酵母发酵产新科斯糖在培养温度为20℃时效果最好,新科斯糖产量最高,这与徐学明等[16]的研究结果一致,法夫酵母的发酵温度较低,在16～22℃范围内生长较好。

2.2.4 发酵时间对发酵生产新科斯糖的影响 以体积分数10%接种量将种子培养基接入上述已优化的发酵培养基,发酵4、8、12、16、24、36、48、72 h后分别测定新科斯糖产量及生物量,结果见图7。

图7 法夫酵母发酵进程曲线Fig.7 The time-course of the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

图7进程曲线表明,前12 h时酵母迅速利用蔗糖,新科斯糖迅速积累,到24 h时,新科斯糖产量达到最高,以后各糖质量浓度基本保持不变,因此确定发酵时间为24 h。

2.2.5 种龄对法夫酵母产新科斯糖的影响 适宜种龄菌体接种可以缩短发酵周期,同时种龄也是决定产酶的重要因素,因此利用最佳种子进行发酵可获取较高新科斯糖产量。

作者分别选取培养16、24、32、40、48、60、72、84 h后的种子培养基,均以体积分数10%接种量接入装有25 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中,初始p H为6.0,培养24 h后分别测定新科斯糖产量和生物量。由图8可知,新科斯糖产量以48 h的种龄为最佳。种龄小于48 h时,由于质量细胞处于幼嫩的指数期,接入发酵培养基时受高质量浓度蔗糖抑制作用较明显,生物量小,果糖苷酶较少,因此新科斯糖产量较低。

图8 种龄对法夫酵母产新科斯糖的影响Fig.8 Effect of inoculum age on the neokestose production byXanthophyllomyces dendrorhous

2.3 正交试验

通过反复试验得知,蔗糖质量浓度、初始p H值、发酵温度是影响新科斯糖产量的重要因素。实验以新科斯糖产量和蔗糖转化率为指标,采用正交试验优化法夫酵母产新科斯糖的发酵条件,结果见表1～3。

表1 正交试验因素及水平Tab.1 The factors and levels of experiment

表2 L9(34)正交试验方案及结果Tab.2 The design and results

表3 新科斯糖产量、蔗糖转化率极差分析结果Tab.3 The range analytic results of neokestose and sucrose yield

由图9正交试验结果效应曲线图可以看出:在对新科斯糖产量的影响中,影响因素为A>B>C;表4方差分析表明,蔗糖质量浓度对新科斯糖产量影响极显著,是主要影响因素。这是由于在产糖过程中,蔗糖作为果糖苷酶的诱导物以及新科斯糖合成的底物而发挥了主要作用。在对蔗糖利用率的影响中,影响因素为A>B>C,其中蔗糖质量浓度和p H值影响显著。这一方面证实了蔗糖的诱导作用,另一方面说明p H值直接影响果糖苷酶的活力,即p H值过高或过低都会使其水解能力下降。综合两个指标及极差分析,确定最佳发酵条件为:蔗糖110 g/L,玉米浆粉8 g/L,p H 6.5,接种体积分数10%,18℃,24 h。以此条件发酵培养,结果所得新科斯糖产量为73.2 g/L,蔗糖利用率为66.5%,比优化前发酵效率提高了87.1%。

表4 正交试验方差分析表Tab.4 The variance analysis of orthogonal results

图9 正交试验效应曲线图Fig.9 The effect curve of orthogonal experiment

3 结 语

法夫酵母269能有效地将蔗糖转化为功能性低聚果糖——新科斯糖。该菌株产新科斯糖的能力受蔗糖质量浓度、氮源种类与质量浓度、培养基初始p H值、种龄、接种体积分数、发酵温度和时间等因素影响,其中尤其以蔗糖质量浓度与初始p H值影响最大。优化条件下发酵可使新科斯糖产量达到73.2 g/L发酵液,比优化前发酵效率提高87.1%。

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(责任编辑:李春丽)

Studies on Fermentation Conditions for Production of Neokestose byXanthophyllomyces dendrorhous

NING Ya-wei1,2, ZHAN GJing-juan2, SU Ding2, YANG Na2, XU Xue-ming1,2
(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Wuxi 214122,China;2.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

In ordertofurtherimprovethetiterandyield ofneokestoseproductionby Xanthophyllomyces dendrorhous,the medium compositions and environmental conditions for neokestose production were optimum by the single factor experiment and the orthogonal experiments,and listed as follows:sucrose 110 g/L,dried corn steep liquor powder 9 g/L,p H 6.5,rotation speed of shaker 220 r/min and inoculation size10%in 25 mL of culture medium in the 250 mL flasks at 18℃for 24 h.The concentration of neokestose by Xanthophyllomyces dendrorhous 269 was achieved at 73.2 g/L,the yield of neokestose on sucrose reached at 66.5%, which was 1.87 times than that of the control.

Xanthophyllomyces dendrorhous,neokestose,fructo-oligosaccharides,submerged fermentation

TQ 920.1

:A

1673-1689(2010)03-0458-06

2009-07-08

教育部优秀人才计划项目(NCET-07-0379)。

＊通信作者:徐学明(1968-),男,江苏苏州人,教授,工学博士,博士生导师,主要从事粮食油脂及植物蛋白工程方面的研究。Email:xmbest@126.com