高效液相色谱法测定复方甘草酸苷分散片中甘氨酸与蛋氨酸的含量

徐先知 肖爱平 刘海燕 周志刚

湖南省长沙市湖南华纳大药厂有限公司，湖南 长沙 410331

复方甘草酸苷分散片是以复方甘草甜素片为原剂型开发的新剂型，它在1948年于日本上市，商品名为美能®，我国于20世纪80年代开始在临床上应用，用于治疗慢性肝病，改善肝功能异常、湿疹，皮肤炎，斑秃。本品组分为甘草酸单铵盐S（以甘草酸计）、甘氨酸和DL-蛋氨酸，但由于甘氨酸与蛋氨酸的均无紫外吸收，故复方甘草甜素片（标准JX20000079）中甘氨酸和蛋氨酸的含量测定方法分别为薄层扫描法和滴定法：前者重复性不好，误差大，后者终点难以判断。本文经试验研究采用通过2，4-二硝基氟苯柱前衍生，建立HPLC法测定甘氨酸和蛋氨酸含量的方法，该方法准确、简便，能很好的控制复方甘草酸苷分散片的质量。

1 仪器和试药

LC-10AT型高效液相色谱仪（岛津），SPD-10A紫外检测器（岛津）；UV2450型紫外分光光度计（岛津）；甘氨酸、蛋氨酸对照品（中国药品生物制品检验所，批号：140689-200401、140684-200401）；乙腈为色谱纯试剂；复方甘草酸苷分散片（湖南华纳大药厂有限公司，批号：090805、090807、090809，规格：每片含甘草酸单铵盐S（以甘草酸计）25mg、甘氨酸25mg、DL-蛋氨酸25mg。

2 方法结果

2.1 色谱条件

色谱柱：大连依利特Hypersil C18柱（4.6mm×200mm），粒度5μm；检测器：SPD-10A紫外检测器；流动相为：0.025mol·L-1醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值至6.0）-甲醇-乙腈（60∶30∶10）；检测波长：360nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含甘氨酸与蛋氨酸都为0.25mg的混合溶液，精密量取该溶液1.0ml，置10ml量瓶中，加0.05mo l·L-1碳酸氢钠溶液（pH9.0）1.0ml及0.8% 2，4-二硝基氟苯的乙腈溶液1.0ml，置50℃水浴中暗处反应60分钟，取出，放冷，用磷酸盐缓冲液（pH 7.0）稀释至刻度，放置20分钟，作为对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品20片，精密称定，研细，取约0.27g，精密称定（约相当于甘氨酸与蛋氨酸各25mg），置100ml量瓶中，加水适量，超声处理20分钟，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，照“2.2.2”项下的“精密量取该溶液1.0ml”起同法制备得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方规定的配比，制成不含甘氨酸和DL-蛋氨酸的样品，照“2.2.2”项下方法制备阴性样品溶液。

2.2.4 测定法 精密量取上述各溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积分别计算甘氨酸和蛋氨酸的含量，即得。

2.3 检测波长的确定

精密吸取上述三种溶液各1ml，分别置25ml棕色量瓶中加流动相稀释至刻度，分别照紫外-可见分光光度法（中国药典2005年版二部附录ⅣA）在190～400nm波长范围内扫描。结果甘氨酸、蛋氨酸和复方甘草酸苷分散片溶液均在360nm波长处有最大吸收，故选360nm作为本品的检测波长，且空白辅料无干扰。

2.4 专属性试验

精密吸取上述三种溶液各10μl注入液相色谱仪，依法测定，记录色谱图，结果甘氨酸、蛋氨酸与其前面相邻峰分离度R大于1.5（见图1）。

图1 复方甘草酸苷分散片溶液(C)HPLC图

2.5 阴性干扰试验

精密量取阴性样品溶液10μl，注入液相色谱仪中，依法测定，记录色谱图。结果空白辅料无干扰（见图2）。

图2 空白辅料溶液HPLC图

2.6 线性相关性试验

分别精密称取甘氨酸与蛋氨酸对照品适量，置100ml量瓶中，从加水适量起同“2.2.2”项下同法制得甘氨酸与蛋氨酸浓度都约为10、15、20、25、30、38ug·ml-1的对照品混合溶液。分别精密量取上述溶液10μl，注入液相色谱仪中，依法测定其峰面积。以甘氨酸和蛋氨酸浓度（ug·ml-1）为横坐标，甘氨酸和蛋氨酸峰面积（A）为纵坐标分别绘制标准曲线，分别得回归方程Y=80703X+2532.1，r=0.9994；Y=41810X+879.69，r=0.9996。结果表明，甘氨酸和蛋氨酸浓度分别在10.58～39.68ug·ml-1、10.44～39.15ug·ml-1与峰面积线性关系良好。

2.7 精密度试验

精密吸取对照品溶液10μl，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定峰面积，甘氨酸和蛋氨酸的平均峰面积分别为1737015、879061，RSD分别为0.20%、0.20%，表明精密度良好。

2.8 重复性试验

取同一批号（批号：090805）的样品6份，分别按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件平行测定，计算含量。甘氨酸和蛋氨酸含量分别为98.9%、99.2%，RSD分别为0.6%、0.7%。表明重复性良好。

2.9 稳定性考察试验

取“2.2.2”项下供试品溶液分别在配制后0、0.5、1、2、4小时，精密量取10μl注入液相色谱仪，测定峰面积，甘氨酸和蛋氨酸的RSD分别为0.1%、0.4%。表明样品溶液在4小时内稳定性良好。

表1 复方甘草酸苷分散片中甘氨酸回收率测定结果

2.10 加样回收试验

取供试品（批号：090805，含量：甘氨酸含量77.0mg·g-1、蛋氨酸含量77.2mg·g-1）20片，研细，取约0.1～0.2g（按高、中、低三种浓度，各平行三份，共9份），精密称定，分别精密加入甘氨酸与蛋氨酸对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述方法测定含量，结果见表1～2。

2.11 样品测定

取三批复方甘草酸苷分散片的样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别进样10μl，测定峰面积，以外标法分别计算甘氨酸和蛋氨酸的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果(n=5)

3 讨论

3.1 衍生反应比例的考察

笔者通过平行设计试验进行比较，当氨基酸与2，4-二硝基氟苯摩尔比在1∶5～1∶10之间时两种氨基酸的峰面积均不再增加，为了减少其它副反应，确定本品衍生时的摩尔比为1∶5。

3.2 衍生反应温度的考察

温度是该衍生化反应的重要指标，当温度在50℃、60℃都能满足本品含量测定的要求，同时参照文献报道，确定该衍生反应温度为50℃。

3.3 衍生反应时间的考察

笔者通过平行设计了四个时间进行试验，结果该反应经过1小时后已定量反应完全，同时参照文献报道，确定该衍生反应时间为60分钟。

[1]进口标准[S].JX20000079：复方甘草甜素片质量标准.

[2]国家标准[S].WS-10001-（HD-1269）-2002：甘草酸单铵盐盐S质量标准.

[3]陈娅兰，付宜和.十八种氨基酸注射液的HPLC 2，4-二硝基氟苯柱前衍生化法含量测定[J].药物分析杂质，1990；10（8）：149～150.

[4]国家药品标准手册.国家药典委员编.第三版.