清肠化湿方对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠TLR-4、NF-κBp65蛋白表达的影响

顾培青 沈 洪 刘 丽 朱 磊 叶 柏 朱萱萱

1 南京中医药大学博士生（南京 210029）

2 江苏省中医院（南京 210029）

3 南京中医药大学硕士生（南京 210029）

清肠化湿方对溃疡性结肠炎模型大鼠结肠TLR-4、NF-κBp65蛋白表达的影响

顾培青1沈 洪2△刘 丽2朱 磊3叶 柏2朱萱萱2

目的观察三硝基苯磺酸（TNBS）法溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜TLR-4、NF-κBp65的变化特点及清肠化湿方对TLR-4、NF-κBp65蛋白表达的影响。方法 采用TNBS诱导大鼠溃疡性结肠炎模型。将大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、清肠化湿方组、巴柳氮组，治疗10d后处死大鼠取新鲜结肠标本，观察黏膜大体形态及组织学改变，并采用Western blot法检测TLR-4、NF-κBp65蛋白表达水平。结果 模型对照组TLR-4、NF-κBp65蛋白表达均高于正常对照组，清肠化湿方组TLR-4、NF-κBp65的表达低于模型对照组，同时清肠化湿方组大鼠结肠形态及组织学损伤评分均有降低。结论清肠化湿方对溃疡性结肠炎模型大鼠具有治疗作用，抑制TLR-4、NF-κBp65的表达可能是其作用机制之一。

清肠化湿方 溃疡性结肠炎 三硝基苯磺酸 大鼠 TLR-4 NF-κBp65 Western blot

1 南京中医药大学博士生（南京 210029）

2 江苏省中医院（南京 210029）

3 南京中医药大学硕士生（南京 210029）

△通讯作者

溃疡性结肠炎 （UC）是一种反复发作的肠道慢性非特异性炎症性疾病，其病机复杂，病因尚未完全阐明，免疫学因素被认为是主要方面。随着免疫学、分子生物学等学科的迅速发展，通过抑制Toll样受体 （TLRs）/核因子-κB（NF-κB）通路的关键分子进而阻断UC的炎症反应已成为研究热点之一。中医学认为，UC活动期以湿热蕴结为主要病机。我们以清热化湿、敛疮生肌为治疗原则，对刘完素治痢名方芍药汤进行化裁，拟制清肠化湿方，用于轻中度UC的治疗，取得了良好的效果。本实验旨在采用TNBS诱发大鼠UC模型，观察清肠化湿方对结肠黏膜TLR-4、NF-κBp65蛋白表达的影响，以探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠，体重（200±20）g，由江苏省中医院药理实验室实验动物中心提供，SPF级环境饲养;清肠化湿方（黄连、黄芩、白头翁、煨木香、炒当归、炒白芍、生地榆、白蔹、肉桂、生甘草）由江苏省中医院药材科提供颗粒剂，按10倍成人用量即16g/kg用蒸馏水配成质量浓度为1.6g/mL悬液;巴柳氮钠片（山西安特生物制药股份有限公司生产），研磨后取10倍成人用量即1.05g/kg用蒸馏水配成质量浓度为0.1g/mL溶液;5%TNBS溶液[西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司];全细胞蛋白提取试剂盒 （Active motif公司）;BCA-100蛋白质定量测定试剂盒（上海碧云天生物科技有限公司）;预先染色的蛋白分子量标准品（Marker，Fermentas life Sciece公司），兔抗TLR4、NF-κBp65多克隆抗体，兔抗β-actin多克隆抗体 （Santa Cruz公司）;显色法免疫检测试剂盒（Invitrogen公司）;ZFMQ050PE型超纯水器（Millipore公司）;3K-30Z型高速冷冻离心机（Sigma公司）;A5002型酶联免疫检测仪（Tecan公司）;垂直电泳仪（GE公司）;半干式转膜仪、硝酸纤维素膜（Bio-Rad公司）;ECL发光剂 （GE公司）;柯达活体成像仪cymentre2000（Kodak公司）;GS-800型光密度扫描仪（Bio-Rad公司）。

1.2 方法 （1）造模：采用TNBS灌肠法制作UC大鼠模型[1]。造模型前禁食24h，留取部分动物作为正常对照组，其余大鼠10%水合氯醛（0.3mL/100g）腹腔注射麻醉;用16号大鼠灌胃针轻轻从肛门插入，推入TNBS溶液（100mg/kg TNBS+50%乙醇0.25mL），捏紧肛门提尾倒立2min后放回笼中自然苏醒，并常规饲养。（2）给药方法与标本留取：造模后第3日，模型动物分为模型对照组、清肠化湿方组和巴柳氮组，并同时按上述剂量给药，给药体积为10mL/kg。正常对照组及模型组给等体积蒸馏水，每日1次，连续10d。末次给药24h后，脱颈椎法处死大鼠，取肛门至盲肠部结肠（约8cm），沿肠系膜纵轴剪开，用冷生理盐水冲洗干净后4%多聚甲醛固定，进行肉眼大体形态评分，肠组织一部分石蜡包埋，4μm连续切片，HE染色镜下评价炎症和溃疡，另一部分-70℃冻存，用于结肠组织中TLR-4、NF-κBp65的检测。（3）大体形态及组织学评分：大体形态按Ekstrom[2]所述的标准进行评分：无损伤计0分，黏膜充血计1分，溃疡面积≤受损面积25%计2分，溃疡面积为受损面积25%～50%计3分，溃疡面积≥受损面积50%计4分，分值范围为0～5分。组织学评分参照Dieleman等[3]标准，根据结肠溃疡深度、范围、炎症程度进行评分。病变深度：无病变计0分，病变侵及黏膜层计1分，病变侵及黏膜下层计2分，病变侵及肌层计3分，病变侵及浆膜层计4分。病变范围：无病变计0分，0% ～25%计1分，26% ～50%计2分，51% ～75%计3分，＞75%计4分;炎症程度：无炎症计0分，轻度计1分，中度计2分，重度计3分;分值范围为0～11分。（4）Western blot法检测结肠组织中TLR-4、NF-κBp65的表达水平：取结肠黏膜按试剂盒说明书提取全细胞蛋白，用BAC-100蛋白质定量测定试剂盒测定蛋白浓度。取蛋白提取液10μL，加等体积的2倍上样缓冲液 （50mmol/L Tris-HCl pH 6.8，2%SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝，1mol/L DTT），沸水浴煮3min，点样于10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDSPAGE电泳，20mA稳流电泳3h。剪取与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜及6张Whatman 3mm滤纸，浸于转移缓冲液（48mmol/L Tris-HCl pH8.3，39mmol/L 甘氨酸，0.037%SDS）中 5min，按下列顺序放置于Bio-Rad电转移装置上：3层滤纸、硝纤膜、凝胶、3层滤纸（注意去除气泡），20V稳压转移1.5h。将硝纤膜取出置一平皿中，加封闭液 （含1%牛血清白蛋白的TBST，10mmol/L Tris-HCl pH7.5，150mmol/L NaCl，0.05%Tween-20），室温封闭4h，弃去封闭液，加入1∶1500稀释的抗TLR4、NF-κBp65多抗（用TBST稀释），4℃反应24h，TBST漂洗3次，每次15min。加入羊抗兔IgG-HRP（TBST稀释 1∶5000 Santa Cruz公司），室温作用2h，TBST充分漂洗3次，每次15min。加入ECL显色液，置于柯达活体成像仪中观察结果，条件设置为曝光5min，CCD自动获取图片结果。相应蛋白表达值为条带的灰度值除以 β -actin（1 ∶1000，Santa Cruz公司，43kD）内参照校正。

1.3 统计学处理 应用 SPSS 13.0统计软件。计量资料以（±s）表示，采用方差分析。

2 结果

2.1 各组大体形态评分 见表1。模型组大鼠可见肠道粘连，肠管胀气，肠壁增厚并变硬，局部充血、糜烂，可见明显溃疡。清肠化湿方组及巴柳氮组均较模型组有改善，巴柳氮组有2只大鼠可见浅溃疡，其余恢复正常或有不同程度的充血、水肿及糜烂，清肠化湿方组及巴柳氮组大体形态评分与模型组比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。清肠化湿方组与巴柳氮组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组大鼠结肠大体形态、病理组织学评分比较 （分，±s）

表1 各组大鼠结肠大体形态、病理组织学评分比较 （分，±s）

与模型组比较，*P＜0.05

n组 别清肠化湿方巴柳氮组模型对照组10 9 8大体形态评分0.80±0.63*1.11±0.60*2.50±0.92病理组织学评分2.60±0.84*3.40±1.01*6.75±1.98

2.2 各组组织学损伤评分 见表1。模型对照组大鼠结肠黏膜组织可见黏膜、黏膜下层可见广泛溃疡形成，大量中性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，腺体破坏，结构紊乱，杯状细胞减少，隐窝脓肿形成。清肠化湿方组及巴柳氮组较模型组明显好转，主要表现为中度慢性炎症，部分黏膜及黏膜下层仍有少量炎细胞浸润，坏死的黏膜上皮基本修复，溃疡愈合，腺体杯状细胞增多，隐窝脓肿消失，较模型对照组明显减轻。清肠化湿方组结肠病理组织学评分和巴柳氮组较模型组结肠病理组织学评分差异均有统计学意义（P＜0.01），清肠化湿方组与巴柳氮组结肠病理组织学评分差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 各组结肠组织中TLR-4蛋白表达比较 见表2，图1。模型对照组大鼠结肠组织中TLR-4表达明显升高，与正常对照组比较，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。清肠化湿方组及巴柳氮组TLR-4表达较模型对照组均降低，差异有显著统计学意义（P＜0.05），清肠化湿方组与巴柳氮组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠结肠组织中TLR-4蛋白表达比较 （±s）

表2 各组大鼠结肠组织中TLR-4蛋白表达比较 （±s）

与正常对照组比较，△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05。下同

n组 别清肠化湿方组巴柳氮组模型对照组正常对照组10 9 8 8灰度比值0.58±0.17*0.62±0.15*0.83±0.18△0.14±0.06

图1 结肠组织中TLR-4蛋白表达

2.4 各组结肠组织中NF-κB p65表达比较 见表3，图2。模型对照组大鼠结肠组织中NF-κB p65表达明显升高，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。清肠化湿方组及巴柳氮组NF-κB p65较模型对照组均有降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。清肠化湿方组与巴柳氮组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠结肠组织中NF-κB p65蛋白表达比较 （±s）

表3 各组大鼠结肠组织中NF-κB p65蛋白表达比较 （±s）

n 组 别清肠化湿方组巴柳氮组模型对照组正常对照组10 9 8 8灰度比值0.39±0.15*0.41±0.12*0.77±0.13△0.08±0.03

图2 结肠组织中NF-κB p65蛋白表达

3 讨论

溃疡性结肠炎近年来在我国的病例报道有逐年增加趋势[4]，已成为临床常见的难治性疾病。UC的发病机制至今尚未完全阐明，但免疫因素在UC中的重要作用已被广大学者所公认，即异常的免疫反应或正常免疫调节的破坏是UC发病的重要环节。

Toll样受体 （TLRs）是一类广泛分布在免疫细胞尤其非特异性免疫细胞以及某些体细胞表面的模式识别受体（PRR）。TLRs通过识别某些病原体或其产物所共有的高度保守的特定分子结构，即病原体相关分子模式（PAMPs），从而介导固有免疫及特异性免疫应答的启动。TLRs作为机体炎性反应链的启动蛋白，为UC的病机研究提供了新的方向。迄今为止在哺乳动物细胞膜上已发现有10种TLRs，包括TLR-1～10，其中TLR-4被认为与宿主的免疫功能关系密切。TLR-4主要识别革兰阴性菌的胞壁成分脂多糖（LPS）并被激活，向细胞内传递活化信号激活NF-κB，从而促进肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）等多种炎症因子的转录，导致结肠黏膜的炎症和损伤。研究表明[5]，正常机体中TLR-4在肠上皮细胞仅微量表达，降低了对肠腔中细菌LPS的识别，从而维持肠道对自身菌群的免疫耐受;而在UC中TLR-4表达显著上调，对LPS呈现异常识别，发生对自身菌群的耐受缺失。可见，TLR-4在结肠组织中高表达是UC发病过程中的重要环节。

核因子（NF）-κB是一类能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其转录的蛋白质。一般状态下，NF-κB二聚体与一种被称为IκB的抑制蛋白结合形成三聚体，以无活性形式存在于细胞浆中。当细胞受到刺激时，IκB激酶（IκK）被磷酸化，IκK即从无活性状态转为活性状态，进而磷酸化IkB，磷酸化、泛酸化的IκB再被26S蛋白酶小体降解，受其抑制的NF-κB得以释放，脱离NF-κB-IκB三聚体，由胞质进入核内，与相应靶基因中的启动子或增强子κB位点结合，诱导靶基因的转录，从而直接参与机体对炎症及免疫反应的调控。NF-κB在许多炎症反应中发挥枢纽作用，尤其是NF-κBp65亚群的激活与UC密切相关。Rogler等[6]采用免疫荧光和免疫组化技术，用特异性的p65单克隆抗体，原位证实了UC患者肠黏膜巨噬细胞和上皮细胞NF-κBp65表达比正常对照者明显增强，且其表达与炎症的严重程度呈正相关。研究已经证实，大部分细胞因子的启动子中均含有NF-κB结合位点，因此，活化的NF-κB可以与这些细胞因子结合并促进其大量表达，引起炎症反应，并使炎症反应放大。NF-κB除调控炎性细胞因子的表达外，与细胞存活和凋亡也密切相关。

本实验表明，UC模型大鼠模型对照组TLR-4、NF-κBp65蛋白表达明显高于正常对照组，清肠化湿方组TLR-4、NF-κBp65蛋白表达均低于模型对照组。提示TNBS法大鼠UC的发病与TLR-4、NF-κBp65的高表达有关，中药清肠化湿方对TNBS法UC大鼠结肠TLR-4、NF-κBp65的表达具有抑制作用，这可能是清肠化湿方治疗UC的作用机制之一。

[1]张涛,谢建群.大鼠溃疡性结肠炎模型的实验研究[J].中国中西医结合消化杂志,2006,14（4）:240～242.

[2]Ekstrom GM.Oxazolone-induced colitis in rats:effects of budesonide,cyclosporin A,and 5-aminosalicylic acid[J].Scand J Gastroenterol,1998，33（2）:174 ～179.

[3]Dieleman LA,Palmen MJ,Akol H,et al.Chronicexperimental colitis induced by dextran sulphate sodium（DSS）is characterized by Th1 and Th2 cytokines[J].Clin Exp Immunol,1998，114（3）:385 ～391.

[4]欧阳钦,胡品津,钱家鸣,等.对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共识意见[J]. 胃肠病学，2007，12（8）：488 ～495.

[5]Abreu MT,Vora P,Faure E,et al.Decreased expression of Toll-like receptor-4 and MD-2 correlates with intestinal epithelial cell protection against dysregulated proinflammatory gene expression in response to bacterial lipopolysaccharide[J].J Immunol，2001，167:1609～1616.

[6]Rogler G,Brand K,Vogl D,et al.Nuclear factor-κB is activated in macrophages and epithelial cells of inflamed intestinal mucosa[J].Gastroenterology,1999，115:357 ～369.

Effects of Qingchanghuashifang Decoction on Protein Levels of TLR-4 and NF-κBp65 in Colonic Mucosa of Rats with Ulcerative Colitis

GU Pei-qing1,SHEN Hong2,LIU Li2,et al
1 Nanjing University of Chinese Medicine（Nanjing 210029）
2 Jiangsu Province Hospital of TCM（Nanjing 210029）

Objective:To observe the effect of Qingchanghuashifang Decoction（QD）on the protein expressions and change character of TLR-4 and NF-κBp65 in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis（UC）.Methods:Rat UC model induced by trinitrobenzene-sulfonic acid （TNBS）were randomly divided into normal group,model group,QD group,and balsalazide sodium tablet（BST）group.The rats were sacrificed to get their colonic mucosa and extract the whole-cell protein after 10d of treatment.Western blot was performed to detect the protein levels of TLR-4 and NF-κBp65.Results:The relative protein expressions of TLR-4 and NF-κBp65 in the model group were all higher than those in the normal group significantly.The relative protein expressions of TLR-4 and NF-κBp65 in the QD group were lower than that in the model group.The colonic configurative and histologic injury score were declined.Conclusion:Qingchanghuashifang Decoction can cure ulcerative colitis.One of the mechanisms may be that Qingchanghuashifang Decoction can inhibit the relative protein expressions of TLR-4 and NF-κBp65.

Qingchanghuashifang Decoction;Ulcerative colitis;Trinitrobenzen-sulphonic acid;Rats;Toll-like receptor 4;Nuclear factor-kappaBp65;Western blot

R285.5

A

1004-745X（2010）01-0099-03

2009-07-21）