高血压脑出血早期血肿周围脑组织细胞凋亡与凝血酶表达相关性的研究

彭绍鹏, 任海军, 高俊玮, 侯博儒, 张建生, 霍龙伟

高血压脑出血(hypertensive intracerebral hemorrhage,HICH)是神经科常见的急、危、重症之一,有较高的病死率和致残率。脑出血后除血肿扩大导致的机械性损伤外,还有脑水肿、细胞凋亡、炎症反应、脑血管痉挛等继发性损伤[1]。研究表明凝血酶是导致脑出血后继发性损伤的重要因素。本实验在不同时间段检测高血压脑出血早期血肿周围脑组织中细胞凋亡与凝血酶表达的变化,从而观察 HICH后凋亡变化的时间窗,并探讨其与凝血酶表达的关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料 实验组标本取自 2008年 6月～2009年 8月因高血压脑出血在我科住院手术治疗的患者。入选标准:(1)术前有高血压病史;(2)经 CT或 MR扫描证实为自发脑内血肿,血肿量幕上﹥ 30ml,幕下﹥ 10ml;(3)GCS≥5分。排除标准:所有患者均排除颅脑损伤、炎症、肿瘤、自身免疫性疾病、颅内动脉瘤、脑血管畸形、使用抗凝剂致脑出血、混合性卒中或出血性梗死以及合并严重心肝肾功能衰竭、糖尿病或严重肺部感染者。根据以上标准共收集病例 36例,其中男 24例,女 12例;年龄 42～73岁,平均 53.4±7.7岁。根据多田氏公式计算出血量,其中出血量 10～20ml者 2例(均为小脑出血),47～62ml者 13例,63～77ml者 18例,78～92ml者 3例,平均 60.3±8.1ml。其中左侧基底节区出血 11例,右侧基底节区出血 23例,小脑出血 2例。按发病至手术的时间分为 5组:＜6h(7例)、6～ 12h(11例)、12～ 24h(8例)、24～ 48h(6例)、48～72h(4例)。对照组 5例标本取自同期在我科住院手术治疗的侧脑室肿瘤的患者,所有患者术前经 MR证实。

1.2 标本采集方法 实验组标本取自高血压脑出血血肿周围的脑组织,血肿位于基底节区者经骨瓣或小骨窗开颅,经侧裂-岛叶入路至血肿腔,吸除部分血肿后紧贴血肿周围用取瘤钳收取标本,直径约 5mm。对照组标本在经皮层入路切除肿瘤时于无血管及出血的脑实质中取得正常脑组织,直径同前,注意避免血液污染。以上组织标本取出后即浸入 4%的多聚甲醛中固定,12～24h后石腊包埋,常温干燥存放。所有手术患者签订知情同意书,不违反伦理道德,不影响患者的康复。

1.3 材料和仪器 TUNEL试剂盒购自南京凯基生物公司。凝血酶兔抗人亲和纯化抗体及 DAB显色剂购自武汉博士德生物工程有限公司。图像采集系统为德国 Leica公司生产。

1.4 凝血酶和细胞凋亡测定 将组织蜡块5μm厚连续切片,常规脱蜡、水合后,采用 TUNEL法及免疫组织化学方法分别检测血肿周围脑组织中凋亡细胞及凝血酶表达。具体操作步骤按说明书进行。镜下 TUNEL阳性细胞胞核或胞浆呈棕黄色,凝血酶阳性细胞镜下胞浆内有棕黄色颗粒。每张切片随机选择 5个视野,高倍镜(400倍)下计数阳性细胞和阴性细胞,计算阳性率(阳性细胞数/细胞总数)和平均值。

1.5 统计学分析 采用 SPSS13.0统计软件进行分析。检测数据用均数 ±标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,相关性检验采用 Spearman相关分析,P﹤ 0.05有统计学意义。

2 结 果

TUNEL显示对照组基本无阳性细胞,＜6h组有轻微表达,6h后逐渐增高,12～24h组增高显著并于24～48h达高峰,48～72h组有所回落,但仍维持较高水平。凝血酶表达变化与此一致。相关分析显示:细胞凋亡与凝血酶表达呈显著正相关(r=0.7451,P＜0.05或 P＜0.01)(见表1)。

表1 高血压脑出血后不同时间凋亡和凝血酶表达的变化±s)

表1 高血压脑出血后不同时间凋亡和凝血酶表达的变化±s)

与对照组相比*P﹤ 0.05,▲P﹤ 0.01;与﹤ 6h组相比△P﹤ 0.01;与 6～12h组相比★P﹤ 0.01;与 12～24h相比◆P﹤ 0.01;与 24～48h组相比◇P﹤ 0.01

例数Tunel凝血酶578640.32±0.0371.28±0.397.19±2.53*6.13±2.07*1115.11±3.69▲△17.56±4.09▲△28.26 ±7.83▲△★34.55 ±8.25▲△★53.79±6.35▲△★◆55.83±9.50▲△★◆38.23±3.29▲△★◆◇40.42±5.37▲△★◆◇253.692256.006

3 讨 论

细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种细胞死亡方式,是机体在生长、发育和受到外来刺激时清除衰老和受损伤的细胞以保持机体内环境平衡的一种自我调节机制,其过程受一系列相关基因及蛋白酶的调控。2003年,Qureshi等[2]在脑出血患者手术标本中发现凋亡现象,血肿周围细胞凋亡的平均比例为 38%。本实验结果显示,HICH后 6h血肿周边 TUNEL阳性细胞表达开始增加,第 12～24小时明显增多,24～48h达高峰,随后逐渐降低。凝血酶表达与此一致,两者有显著的相关性。

凝血酶是由凝血酶原转变而来的多功能丝氨酸蛋白酶,主要参与凝血、抗凝、血栓形成和纤溶的调节。生理情况下,凝血酶原主要由肝脏合成,凝血级联反应激活后产生的 Xa可使凝血酶原裂解形成凝血酶。凝血酶具有双重细胞效应[3],低浓度(＜1μ/ml)有神经保护作用,而高浓度的凝血酶作用一定时间后可导致组织损伤及细胞凋亡[4]。Xue等[5]将 25U凝血酶或血浆注入大鼠纹状体,除了大量炎细胞浸润及反应性胶质细胞增多,还检测到神经细胞凋亡。

脑出血后凝血酶的产生来自 3个方面:(1)脑出血后血肿凝固过程产生的大量凝血酶;(2)血脑屏障破坏后血液中部分凝血酶进入血肿周围组织;(3)局部脑组织损伤后新的凝血酶原生成[6]。生理情况下每毫升血浆可产生 210～360U的凝血酶,而 1ml血仅需 1U凝血酶即可在 15s内凝固。故脑出血时大量富余的凝血酶渗透到组织间隙,直接对神经组织造成损伤。李恒等[7]在动物模型中发现,脑出血后 12h凝血酶显著增加,48h达高峰,本实验结果与此基本一致。

有关凝血酶导致凋亡的机制尚不清楚。杨文琼等[8]在动物实验中发现凝血酶可能是通过抑制 Bcl-2的表达,增强 Bax的表达,降低 Bcl-2和 Bax的比值,激活 JNK信号传导通路导致海马神经元凋亡。关景霞等[9]发现凝血酶还可促进凋亡调控因子Caspase-3的表达。新近发现凝血酶诱导神经细胞凋亡与干扰细胞周期有关。Rao等[10]在培养的神经元加入凝血酶后发现细胞周期蛋白 cyclinD1和 cyclinE减少,并发现凝血酶可诱导周期素依赖性蛋白激酶 4(Cdk4)和促凋亡蛋白 Bim的表达,而 cdk4的抑制剂可阻止 bim的表达和凝血酶诱导的神经细胞凋亡。

脑出血后凝血酶表达与神经细胞凋亡的相关性为脑出血后抗凝治疗提供了一定的依据。方琪等[11]报道凝血酶抑制剂水蛭素能减轻凝血酶的致凋亡作用。新型凝血酶抑制剂阿加曲班在 Matsuoka等[12]的临床实验中得到了可喜的成果,但其具体实施尚有待发掘。高血压脑出血后采取手术清除血肿还是钻颅引流不同学者有不同看法,但脑出血后血凝块可释放大量凝血酶并引起继发性神经损伤,这无疑为脑出血后及时清除血肿提供了一定的理论依据。

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[3] Zain J,Huang YQ,Feng X,et al.Concentration-dependent dual effect of thrombin on impaired growth/apoptosis or mitogenesis in tumor cells[J].Blood,2000,95(10):3133-3138.

[4] Ahmad R,Knafo L,Xu J,et al.Thrombin induces apoptosis in human tumor cells[J].Int JCancer,2000,87(5):707-715.

[5] Xue M,Del Bigio MR.Acute tissue damage after injections of thrombin and plasmin into rat striatum[J].Stroke,2001,32(9):2164-2169.

[6] Citron BA,Smirnova IV,Arnold PM,et al.Upregulation of neurotoxic serine proteases,prothrombin,and protease-activated receptor 1 early after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2000,17(12):1191-1203.

[7] 李 恒,吴 鹤,丛玉玮,等.大鼠脑出血后脑组织蛋白酶连接素-1、凝血酶和蛋白酶激活受体-1表达变化的实验研究[J].中华神经医学杂志,2009,8(10):1006-1010.

[8] 杨文琼,吴 艳,孙圣刚.凋亡调控因子在凝血酶诱导海马神经元凋亡中的变化[J].中华神经医学杂志,2007,6(11):1109-1113.

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[10] Rao HV,Thirumangalakudi L,Desmond P,et al.Cyclin D1,cdk 4,and Bim are involved in thrombin-induced apoptosis in cultured cortical neurons[J].J Neurochem,2007,101(2):498-505.

[11] 方 琪,包仕尧.凝血酶与神经细胞凋亡的实验观察[J].中风与神经疾病杂志,2002,19(6):341-343.

[12] Matsuoka H,Hamada R.Role of thrombin in CNS damage associated with intracerebral haemorrhage:opportunity for pharmacological intervention[J].CNS Drugs,2002,16(8):509-516.