替米沙坦抑制SHR大鼠心肌Smad2、3蛋白表达及减轻心肌纤维化作用的研究

曲 巍，于 波

（中国医科大学附属第一临床学院心内科，辽宁沈阳 110001）

替米沙坦抑制SHR大鼠心肌Smad2、3蛋白表达及减轻心肌纤维化作用的研究

曲 巍，于 波*

（中国医科大学附属第一临床学院心内科，辽宁沈阳 110001）

目的：探讨替米沙坦对自发性高血压大鼠(SHR)心肌纤维化的抑制作用，及心肌Smad2、3蛋白表达的影响。方法：将20只雄性SHR大鼠随机分为两组，分别为替米沙坦组和对照组。分别给予替米沙坦10 mg/(kg·d)，对照组二甲亚砜1 ml/d灌胃，共8周。于实验前、2周、8周，应用尾套法测血压3次。8周后分离血浆检测血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）水平。心肌石蜡切片通过免疫组化法测定Smad2、3蛋白和Ⅰ型胶原的表达。结果：灌胃8周后，与对照组相比，替米沙坦组AngⅡ水平明显升高（P<0.05）；Smad2、3蛋白和Ⅰ型胶原的表达明显降低（P均<0.05）。结论：替米沙坦能抑制心肌纤维化，这一作用可能部分通过抑制Smad2、3蛋白表达来实现。

替米沙坦；心肌纤维化；Smad2、3蛋白

心肌纤维化（myocardial fibrosis,MF）是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同病理改变，是心肌重构的主要表现之一。这种病理变化在多种心血管疾病中存在，与心律失常、心力衰竭密切相关。MF是高血压左室重构的主要表现之一[1]。表现为细胞外基质合成与降解之间失衡。间质中胶原沉积增多，各种胶原比例失调（Ⅰ/Ⅲ型胶原比率增加）的排列紊乱。业已证实，在影响MF的诸多因素中，肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活，AngⅡ水平增高是导致MF的主要原因。AngⅡ通过AT1受体介导机制调节心肌细胞中TGF-β1形成。TGF-β/Smads信号转导通路是TGF-β发挥生物学作用的主要通路，其分子组成与分子调节复杂，与其他信号通路存在广泛交互影响，对心肌纤维化的发生和发展有明确作用[2]。Smads蛋白分为 3 种，受体调节蛋白 Smad2、3，通用蛋白Smad4和抑制蛋白Smad6与Smad7。

而血管紧张素受体拮抗剂（ARB），虽然使AngⅡ水平增高，但也能抑制MF,其作用机制是一方面抑制AT1受体，另一方面过度激活AT2受体。本研究通过其抑制Smad 2、3，胶原蛋白Ⅰ的表达，进一步证实其抑制心肌纤维化的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

替米沙坦原料药购自武汉富驰生物科技有限公司。兔抗大鼠Smad2、3抗体、兔抗大鼠Ⅰ型胶原抗体购自武汉博士德生物工程有限公司。鼠AngⅡ放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所。

1.2 动物及分组

SHR雄性大鼠20只购自北京维通利华公司，体重200 g左右。将实验动物随机分为两组：①替米沙坦组，10只，给予替米沙坦10 mg/(kg·d)灌胃8周；②对照组，10只，给予等量溶剂二甲亚砜1 ml/d灌胃，共8周。

1.3 方法

1.3.1 实验前、2周后、第8周处死动物前，测大鼠血压：应用尾套法测定大鼠尾动脉收缩压，配以大鼠尾容积脉搏波动的声光显示。测量血压前大鼠预置于38～40℃室温20 min，使尾动脉充分扩张后，将鼠尾套于压敏传感器上。捏水银检压计气球，向尾套气囊内充气，指导容积脉搏消失，再缓慢放气，当再听到规律声音时，血压表所指刻度为尾动脉收缩压。连续测3次，取平均值。

1.3.2 8 周后取血处死动物：10%水合氯醛0.03 ml/kg腹腔注射麻醉后，腹主动脉采血8～10 ml处死大鼠。分离血清用放射免疫的方法检测AngⅡ水平。

1.3.3 大体心脏标本计算左室相对重量、左室截面直径：①心室重量及心室重量指数的测定待血流动力学指标测定完成后，迅速打开胸腔摘取心脏，在冰生理盐水中洗去血液，去除心室周围组织，用电子天平(精确到0.01 mg)称取心室重量(HW)，分别与体重相除，计算心室重量指数(VWI：HW/体重)。②左室截面直径的测定参照张沛等[3]的方法测量，测完心脏重量后，迅速置于4%多聚甲醛固定液固定心肌组织。固定1周后，于长轴中点垂直横切心脏，直接法测量左室腔内径(D)，即分别测定最短径(DAMIN)和最长径(DMAN)，取其几何平均值。

1.3.4 测定血浆AngⅡ水平：腹主动脉取血至少2 ml制备血浆（EDTA-Na2抗凝），采用放射免疫法测定。

1.3.5 SHR大鼠心肌Smad2、3蛋白和Ⅰ型胶原的表达：取心肌石蜡切片行Smad2、3蛋白和Ⅰ型胶原的免疫组化法测定。一抗为Smad2、3蛋白和Ⅰ型胶原抗体，PBS缓冲液代替一抗作为空白对照，根据ABC法试剂盒进行操作，DAB显色。显微镜下400倍观察，阳性表达呈棕黄色。

1.4 统计学分析

用SPSS 11.0软件进行统计学处理。数据以均数±标准差表示，组间进行重复测量资料的方差分析。等级资料用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 替米沙坦对血压的影响

见表1。

表1 实验前、2周、8周血压值(±s,mmHg)

表1 实验前、2周、8周血压值(±s,mmHg)

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替米沙坦组8周血压值较实验前下降，与对照组实验前后相比，血压值更低（P均<0.05）。

2.2 大体心脏标本计算左室相对重量、左室截面直径的结果

见表2。

表2 左室相对重量、左室截面直径(±s)

表2 左室相对重量、左室截面直径(±s)

替米沙坦组对照组组别 左室相对重量（10-3） 左室截面直径(mm)2.240±0.214 2.812±0.330 11.38±0.54 12.23±0.61

替米沙坦组的左室相对重量、左室截面直径都小于对照组（P 均<0.05）。

2.3 血浆AngⅡ水平的结果

替米沙坦组AngⅡ水平（ng/L）高于对照组[(1 124.5±8.13)vs(726.5±5.72)，P<0.05]。

2.4 替米沙坦对SHR大鼠心肌Ⅰ型胶原、Smad2、3蛋白表达的影响

显微镜400倍下观察结果，全部视野阳性染色 <10%为（-）；10%～25%为（+）；26%～50%为（++）；51%～75%为（+++）；>75%为（++++）。8周后，免疫组化染色显示，Ⅰ型胶原在肌束间隙及细胞间隙成束排列。与对照组相比，替米沙坦组Ⅰ型胶原表达明显减少（图 1、2）（P<0.05）。 Smad2、3 蛋白为主要分布于胞质中的棕黄色颗粒。与对照组相比，替米沙坦组Smad2、3 蛋白表达明显减少（图 3、4）（P<0.05）。

3 讨论

TGF-β1在MF中起重要作用，同时作为一个强有力的调节因子，它的作用通过TGF-β1/Smads信号转导通路来实现。近年来心肌梗死后Smad信号被激活的研究比较多。心肌梗死后TGF-β激活Smad信号，促进成纤维细胞增殖，前胶原蛋白Ⅰ和纤维连接蛋白（FN）合成，抑制细胞外基质降解[4]；激活诱导细胞凋亡的蛋白激酶[5]。Ghosh-Choudhury也证实Smads在心肌细胞凋亡过程中起到信号转导作用[6]。ARB能减弱TGF-β和Smad的活性，从而减轻再灌注心肌的纤维病变。保护心肌梗死后心肌细胞的功能[7]。

而对于高血压引起心肌纤维化过程中，Smad2、3的作用及血管紧张素受体拮抗剂的作用研究较少。随着ONTARGET及NAVIGATOR研究结果的公布，血管紧张素受体拮抗剂的表现不尽如人意。甚至NAVIGATOR研究结果显示，缬沙坦与安慰剂相比不能带来更多的心血管获益。在这样的困惑中，需要更多与ARB相关的基础研究。

本研究表明，替米沙坦能抑制Ⅰ型胶原的生成，抑制Smad2、3诱导的心肌纤维化，在SHR大鼠的心肌纤维化过程中起到明显的心肌保护作用。这个结果是否明确，还需进一步的研究反复证实。替米沙坦的研究结果能否推广到所有ARB，还需更多的研究和努力。

[1]Treasure CB,Klein JL,Weintraub WS,et al.Beneficial effects of cholesterol-lowering therapy on the coronary endothelium in patients with coronary artery disease[J].N Engl J Med,1995,332(8):481.

[2]张海啸,史载祥.转化生长因子-β信号传导通路与心肌纤维化[J].中日友好医院学报,2007,21(2):110-112.

[3]张沛,杨跃进,宋来凤,等.小剂量依那普利对大鼠急性心肌梗死左室重构和功能的影响[J].中华老年心脑血管病杂志,2000,2(3):40-41.

[4]Wang B,Omar A,Angelovska T,et al.Regulation of collagen synt hesis by inhibitory Smad7 in cardiac myofibroblasts[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(2):1282-1290.

[5]Chipuk JE,Bhat M,Hsing AY,et al.Bcl-xL blockst ransforming growt h factor-beta 1-induced apoptosis by inhibiting cytochrome c release and not by directly antagonizing Apaf-1-dependent caspase activation in prostate epit helial cells[J].J Biol Chem,2001,276(28):26614-26621.

[6]肖健,王志农.Smads在心肌细胞凋亡过程中的信号转导[J].生理科学进展,2009,40(2):185-187.

[7]Euler-Taimor G,Heger J.The complex pat tern of SMAD signaling in t he cardiovascular system[J].Cardiovasc Res,2006,69(1):15-25.

Telmisartan inhibited protein Smad2,3 expression and reduced myocardial fibrotic remodeling in SHR

QU Wei,YU Bo*
(Department of Cardiology,First Affilated Hospital of China Medical University,Liaoning Province,Shenyang 110001,China)

Objective:To explore the effects of telmisartan on myocardical fibrotic remodeling and involvement of protein Smad2,3 expression.Methods:Twenty male SHR were randomly divided into 2 groups,telmisartan group and comparative group.Telmisartan group were poured telmisartan 10 mg/(kg·d);comparative group were poured dimethyl sulfoxide 1 ml/d in stomach.Before,after two weeks and 8 weeks treatment,the blood pressure were measured by tail-sleeve method.At week 8,the levels of AngⅡin plasma were measured by radioimmunoassay kit.After week 8,the protein levels of Smad2,3 and collagenⅠwere assayed by angiography and histomorphometric analysis.Results:Following 8 weeks treatment,telmisartan group displayed a significant elevation in the levels of AngⅡ,P<0.05,and reduction in Smad2,3 and collagenⅠ(P<0.05 respectively).Conclusion:Telmisartan attenuates myocardical collagen synthesis in SHR possibly through downregulating the expression of Smad2,3.

Telmisartan;Myocardial fibrosis;Smad2,3

R-332

A

1674-4721（2010）09（a）-021－03

*通讯作者

2010-08-02）