复方维生素注射液（4）细菌内毒素检查法的建立

胡守莲，李道明

（河南省信阳市食品药品检验所，河南信阳 464000）

复方维生素注射液（4）细菌内毒素检查法的建立

胡守莲，李道明

（河南省信阳市食品药品检验所，河南信阳 464000）

目的：建立复方维生素注射液（4）细菌内毒素检查的方法。方法：用两个生产厂家的鲎试剂对两个厂家6个批号的复方维生素注射液（4）分别进行干扰实验，考察确立该品种细菌内毒素的检测方法。结果：复方维生素注射液（4）对细菌内毒素检查有干扰作用，但稀释100倍以上可消除。结论：可以用细菌内毒素检查法（凝胶法）代替家兔热原检查法控制其热原。其细菌内毒素限值为50 EU/ml。

复方维生素注射液（4）；鲎试剂；细菌内毒素；干扰试验

复方维生素注射液（4）为维生素类药物，是机体维持正常代谢和功能所必需的一类低分子化合物。其多数由食物提供，少数可在体内合成或由肠道细菌产生[1]，主要用于大面积及严重创伤者、外科疾病伴有肠功能障碍者(如肠瘘、短肠综合征)、危重患者中较长时间不能进食者。静脉滴注给予维生素能对危重患者起到维持、延长和挽救生命的作用，对正常进食或超高代谢的患者起到纠正负氮平衡，促进伤口愈合，增加体重以及提高存活率的作用[2]。本品现行标准为国家食品药品监督管理局药品标准YBH19942005[S]，该标准项下以热原（家兔法）检查来控制热原质。由于家兔法操作比较繁琐，环境要求高，成本比较大，而细菌内毒素检查法具有灵敏快速、简便易行、经济实用等优点，故笔者参照《中国药典》2005年版二部附录XI E细菌内毒素检查法 （BET）[2-4]的要求，对采用细菌内毒素检查法（凝胶法）对复方维生素注射液（4）进行检测的可行性进行探讨。

1 材料与仪器

复方维生素注射液（4）[规格 2 ml，批号：080926、090320、080926，陕西秦光制药厂；规格 2 ml，批号：0905301、0804181、0804171，四川美大康佳乐药业有限公司。实验前热原检查均符合规定）。内毒素工作标准品（WSE）（中国药品生物制品检定所，批号：2009-10，每支 100 EU）。 鲎试剂（TAL）（湛江安度斯生物有限公司，批号：0911220，规格 0.1 ml，灵敏度0.25 EU/ml；湛江博康海洋生物有限公司，批号：0906020，规格0.1 ml，灵敏度0.25 EU/ml）。细菌内毒素检查用水（BET水）（中国药品生物制品检定所，批号 W2009－3，每支 10 ml）；电热恒温水浴箱（北京市医疗设备厂）。2H-2自动旋涡混合仪（天津药典标准仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度的复核

按照《中国药典》2005年版二部细菌内毒素检查法项下的规定进行[4]，结果（见表 1）：鲎试剂灵敏度在 0.5～2.0 λ 之间，结果符合规定。

表1 鲎试剂灵敏度复核试验结果

2.2 内毒素限值的确定

根据公式L=K/M，L为样品的细菌内毒素限值；K为按规定的给药途径，人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂为5 EU/(kg·h)；M为人每千克体重每小时用药最大剂量；本品人用每次最大剂量为2 ml（加入500 ml葡萄糖、氯化钠、氨基酸等输液中静脉滴注），即M＝2/60＝1/30 ml/(kg·h)（人均体重按 60 kg 计），则 L＝K/M=5/（1/30）=150 EU/ml。 为提高质量标准，保证人体用药安全，把L值定为50 EU/ml.

2.3 干扰试验

2.3.1 干扰预试验 由于本品的L值定为50 EU/ml,所以对应于市场常见的鲎试剂（灵敏度为0.50～0.03 EU/ml），按照公式MVD＝CL/λ 计算，得到系列有效稀释度的样品液，即 1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600。采用灵敏度 λ＝0.25 EU/ml的鲎试剂，将样品用 BET 水配制成 1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400 的5个系列浓度，作为供试品液（NPC），并配制此系列稀释液分别含2 λ的供试品阳性液（PPC），分别将NPC和PPC两个系列的样品液与鲎试剂反应（37℃，60 min）[5]，结果见表2。

表4 复方维生素注射液（4）的细菌内毒素检查结果

表2 预干扰实验测定结果

2.3.2 干扰实验 用BET水和1∶200的样品稀释液将WSE稀释成 0.500、0.250、0.125、0.062 EU/ml的 2 个系列浓度，并与两个厂家的TAL反应，实验重复4管，结果显示两个系列的内毒素溶液反应终点浓度均在0.5～2.0 λ之间[6]。见表3。

表3 复方维生素注射液（4）干扰实验结果

2.4 复方维生素注射液（4）的细菌内毒素检查

取两个厂家生产的复方维生素注射液（4）各3批（陕西秦光制药厂，规格：2 ml，批号：080926、090320、080926；四川美大康佳乐药业有限公司，规格：2 ml，批号：0905301、0804181、0804171），分别用 BET 水配制成 1∶200 的稀释液，用两个厂家生产的灵敏度为0.25 EU/ml的鲎试剂，按照《中华人民共和国药典》2005年版二部细菌内毒素检查法[4]依法检查。结果见表4。

3 讨论

为初步确定复方维生素注射液（4）对鲎试剂凝集反应的影响，确定最大不干扰浓度，正式实验前进行了干扰实验的预实验[7-9]，试验结果表明复方维生素注射液（4）对细菌内毒素检查有干扰作用，但稀释100倍以上可消除。

为进一步考察供试品对鲎试剂是否存在干扰作用，笔者采用两个厂家的鲎试剂（灵敏度均为0.25 EU/ml），两个厂家的6批样品进行了正式干扰试验，结果表明样品在最大稀释浓度（200倍）不干扰实验，可依该方法进行检测。

用两个厂家鲎试剂分别与两个厂家的6批样品进行细菌内毒素检查，其结果均符合规定，这与热原检查的结果一致。

本试验的结果表明采用鲎试剂法（凝胶法）代替传统的家兔法对复方维生素注射液（4）的热原质进行控制是完全可行的，其内毒素限值为50 EU/ml。

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Establish of the Bacterial Endotoxins Test of Compound Vitamin(4)Injection

Objective:To establish the BacterialEndotoxins Test of Compound Vitamin(4)Injection.Methods:The interference test of 6 batches of samples with 2 limulus test agents was carried out.Results:There was interference effect of Compound Vitamin(4)Injection on the reaction of bacterial endotoxin and tachypleus amebocyte lysate.But the interference can be neutralized by diluting the solution concentration to 1∶100.Conclusion:These results suggest that the Bacterial Endotoxins Test can be used for the detection of endotoxin in Compound Vitamin(4)Injection instead of pyrogen test,and its endotoxin limit concentration can be established as less than 50 EU/ml.

Compoundvitamin(4)injection;Limulus test agent;Bacterial endotoxins test;Interference test

R977.2

B

1674-4721（2010）09（b）-044-02

胡守莲，女，主管药师，主要从事药品检验。

HU Shoulian,LI Daoming

(Institute for Food and Drug control of Henan Xinyang,Xinyang 464000,China)

2010-07-07）