核酸适配子在生物医学领域中的应用

侯,魏 磊,吴 军,侯 巍,孙 非*

(1.吉林大学再生医学科学研究所,吉林 长春 130021;2.空军航空大学门诊部,吉林 长春 130022;3.解放军208医院461临床部,吉林 长春 130021)

核酸适配子在生物医学领域中的应用

(1.吉林大学再生医学科学研究所,吉林 长春 130021;2.空军航空大学门诊部,吉林 长春 130022;3.解放军208医院461临床部,吉林 长春 130021)

*通讯作者

1990年Tuerk[1]和Ellingto[2]报道了一种在体外应用随机单链寡核苷酸文库筛选、扩增特定配体的技术,此种技术可以得到能与非核酸靶分子具有高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸序列,此技术称为指数富集配基的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX),筛选出的寡核苷酸序列称为核酸适配子(aptamer)。由于核酸适配子与抗体类似,与靶物质结合的特异性和亲和力可甚至优于抗体,加上其靶分子广、稳定性强、易改造修饰等特点,可在基础研究、临床诊断、药物研发等方面得以广泛应用[3]而受到关注。本文对核酸适配子目前在生物医学领域中的应用作一综述。

1 SELEX技术原理与特点

1.1 SELEX技术的原理[1]

SELEX技术筛选核酸适配子的过程主要有以下几个步骤:①预先设计并合成寡核苷酸文库(DNA文库或RNA文库)。文库中的寡核苷酸的两端是固定序列(可依此设计PCR扩增的引物),中间随机排列约25-30个寡核苷酸,所以文库的总量可达l014-15;②文库的筛选。将靶分子与文库进行混合孵育,使其能与靶物质特异性结合,形成靶物质-寡核苷酸复合物,后可采取滤膜法、磁珠法、毛细管电泳法或柱层析等不同的分离方法,将与靶分子结合的寡核苷酸从文库中分离出来。靶分子的混合物,通过PCR扩增后,再进行重复筛选。一般筛选8-20轮左右,最后将筛选到的核酸适配子文库进行克隆、测序并鉴定所筛选的核酸适配子与靶分子结合的特异性和亲和力。也可通过后续实验验证所得适配子与靶分子结合的最短序列。

1.2 核酸适配子的特点

1.2.1 应用范围广 寡核苷酸随机库的每个核苷酸种类都存在4种可能性(A、C、G或T),若随机区有n个核苷酸,随机序列有4n种可能性。30个左右的核苷酸文库的容量能达到l014-15。单链寡核苷酸的一个独特表现是容易形成各种形状的二级结构和三级结构,空间结构的多样性几乎可以与所有种类的分子发生作用。适配子可以通过氢键、范德华力等与靶分子相互作用而形成稳定的复合物,有研究表明,适配子与靶分子的结合是相互诱导的适应性识别,当靶目标存在时,单链DNA或RNA发生适应性折叠与靶分子相互识别[4]。目前,SELEX技术所筛选的靶分子广泛,可包括蛋白质、多糖、金属离子、核酸、酶、完整的细胞、病毒颗粒、病原菌等。因此,与其他文库筛选技术相比,SEIEX技术适应范围更加广泛。

图1 SELEX技术筛选核酸适配子的基本原理

1.2.2 高特异性和亲和力:核酸适配子只识别与其互补的分子空间结构,能够分辨出靶分子结构上的细微差别。与靶分子的结合解离常数(kd)可达nmol/L甚至pmol/L水平,比抗体或其他类型配基有更高的亲和力和特异性,几乎可以完全避免非特异性结合[5]。如茶碱与其他黄嘌呤类似物咖啡因、可可碱的结构非常相似,常规的茶碱单抗与后两者有交叉反应,而核酸适配子只特异结合茶碱,与其他两种物质无反应,且与茶碱的亲和力比与咖啡因高10 000倍。

1.2.3 制备简单、产品稳定 核酸适配子与抗体相比,分子量小(5-25 ku),制备简单、产生不依赖于动物、低成本、易重复、毒性低、免疫原性低、即使针对有毒物质也可筛选出其相应的适配子[6]。虽然适配子易被体内的核酸酶所降解,但各种核酸修饰方法可使适配子在体内的半寿期大大延长,稳定性增加;另外,适配子与聚乙二醇(PEG)等大分子物质结合可大大增加它的生物利用度。这些均为适配子作为治疗试剂打下了基础[7]。

适配子与单克隆抗体或者其他小分子药物的作用机理更为相似。核酸适配子的特性使它们在作为治疗药物和诊断试剂某些方面甚至超越抗体[8-9]。

2 核酸适配子在疾病治疗中的应用

2.1 抗凝血作用

由于核酸适配子的作用方式是直接结合并抑制已经存在的蛋白的活性,并且具有相对的安全性,价格适中等优点,正成为一种新型抗凝药物。

凝血酶是凝血系统的重要调节因子,它可使纤维蛋白原转变为纤维蛋白,产生凝血作用。核酸适配子ARC183是Archemix公司研制的已经进入临床实验的凝血酶抑制剂,可作为冠状动脉旁路移植过程中的抗凝药物[10]。它是一个长15nt的DNA分子,与凝血酶结合的解离常数(Kd)为2 nmol/L,与凝血酶原的Kd为50 nmol/L。ARC183在体外有很强的抗凝作用,可以抑制纤维蛋白原在凝血酶作用下的激活以及凝血酶引起的血小板聚集,与肝素相比,它可以降低肝素诱导的血小板减少症的发生率,有效抑制凝血酶。在狗和猴的心肺分流术动物模型中,给予0.5 mg/kg.min-1的剂量,其活化凝血时间(activated clotting time,ACT)为1 500 S。它在体内只有约100 S的半寿期,可快速逆转其抗凝作用,未见明显的毒性作用和过度出血,显示了临床应用安全性。

适配子的短半寿期对抗凝血适配子是个有利的方面,而对于其它适配子的应用来说,如何防止被核酸酶降解是提高在体内作用稳定性的重要方面。已有多种修饰方法来修饰核酸适配子,其中较常见的是2′-氟和2′-氨基的修饰。例如:特异针对凝血因子IXa的适配子进行了2′-氟嘧啶修饰,同时在5‘端连接胆固醇分子,使得适配子在血循环中的时间从10 min提高到1-1.5 h。在单次注射剂量为0.5 mg/kg时可使其抗凝血作用时间大于1h[11]。如何对适配子的这种长时间抗凝作用进行清除,Rusconi等[12]巧妙设计了此适配子的“解毒剂”。他们合成了17nt的针对适配子序列的反义寡核苷酸,它可通过杂交作用来抑制适配子的功能。在动物模型中注入10 min后,此反义核酸就可中和适配子的95%的抗凝作用。

2.2 抗病毒

特异针对病毒外膜蛋白、整合酶、逆转录酶等的适配子均可用于抗病毒治疗。人类免疫缺陷病毒(HIV)包膜糖蛋白由一个外部糖蛋白(gp120)和跨膜域(gp41)组成,并在病毒进入到细胞中的重要作用。

Jiehua等[13-14]成功的筛选出具有双重功能的一系列抑制gp120核酸适配子,具有比抗体更好的阻止病毒复制的作用。

丙型肝炎病毒非结构区(HCV NS3)蛋白是治疗HCV的一个重要靶标。Fukuda K等[15]以HCV NS3h为靶分子,从体外合成的81bp随机单链DNA文库中筛选得到与HCV NS3h特异结合的寡核苷酸适配子,适配子在体外对HCV NS3h的活性具有一定的抑制作用。Fukuda等[16]提纯了针对NS3的RNA适配子,试验表明该适配子能够抑制NS3的90%的蛋白水解酶活性,而且在体内能够抑制麦芽糖结合蛋白-NS3(MBP-NS3)70%的蛋白水解酶活性。最近,Jeon等[17]筛选出了能封闭流感病毒受体结合域而抑制流感病毒感染的DNA适体。

2.3 抗增殖作用

血管生成在肿瘤侵袭、转移过程中发挥作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth fac.tor,VEGF)是血管生成的重要调节因子,在大多数实体瘤和某些病理情况下升高。针对VEGF165的具有核酸酶抗性的RNA适配子可以有效阻止VEGF与人脐带血管内皮细胞结合和VEGF诱导的细胞增生。抗VEGF165的适配子可抑制人神经母细胞瘤细胞株神经生长因子的生长。湿性老年黄斑变性是老年人失明的主要原因。VEGF165 RNA适配子可局部应用治疗湿性老年黄斑变性,临床试验效果较满意[18]。

转录因子E2F是调节细胞增殖的主要因子之一。Mann[19]将E2F适配子用于抑制静脉搭桥术后血管内皮增生的设想。通过还原压力介导转染法将E2f适配子转入将移植的静脉,结果12个月后,应用E2F适配子治疗组的移植血管的闭塞率,狭窄率明显较对照组低。

Farokhzad等[20]用携带多烯紫杉醇(docetaxe1)的海绵状纳米颗粒,其中含有辅聚物PLGA-b-PEG和对PSMA胞外部分特异的RNA适配子A10。体外实验中,此复合物可特异结合于前列腺癌LNCaP细胞表面表达的PSMA蛋白,显著增加其细胞毒性。单次瘤内注射,可使5/7的LNCaP细胞移植的裸鼠模型中的肿瘤全部消退,而且在109天内100%存活,对照组存活57%。此研究为将核酸适配子转移进入细胞以及疾病的靶向治疗提供了新的方法。

李真真[21]等建立SELEX技术筛选胃癌细胞SGC-7901适配子的方法,并初步鉴定获得的SGC-7901细胞适配子。他们在体外合成全长88bp中间含52bp随机序列的ssDNA文库,通过优化PCR扩增条件,利用地高辛一抗地高辛抗体一碱性磷酸酶系统测定亲和力,经SELEX反复筛选获得胃癌SGC一7901细胞的特异性适配子。成功建立了SELEX技术体外筛选胃癌细胞SGC-7901高亲和性适配子的方法。

3 核酸适配子在诊断中的应用

核酸适配子与靶物质结合所呈现的高特异性和敏感性,使其在临床诊断中具有广泛的应用前景,应用适配子检测靶蛋白的研究不断增多,基于适配子的检测新技术也不断出现。

3.1 生物传感器

生物传感器是依赖于分子识别元件的作用来构建的。通常,生物传感器的识别元件主要是抗体、酶、受体和核酸等。目前已有大量的各类型生物传感器应用在实际工作中。但是这些传感器均具有一定的局限性,如单抗或多抗的制备比较繁琐、固定时活性易损失、活性保存时间有限、使用时对环境和样品条件要求比较高。然而,通过SELEX技术筛选得到的寡核苷酸适配子具备类似抗体一样的对靶分子高的亲和力和特异性,但相比大分子的抗体,寡核苷酸适配子分子量小,结构简单,能保证合成的精确性及易连接其它分子进行修饰,如荧光素、生物素等。同时,寡核苷酸适配子可以变性、复性且速度快,可反复使用、长期保存。基于寡核苷酸适配子的这些优点,将适配子作为生物传感器的识别元件,制成适配子生物传感器(Aptasensors),具有不可替代的优势。

3.1.1 适配子电化学生物传感器:Ikebukuro等[22]研制出一种电流型电化学传感器,利用两种作用于凝血酶不同靶位的核酸适配子对凝血酶不同表位,一种用作捕捉分子,另一种用作检测分子,以“三明治”夹心方式构建化学生物传感器,成功地建立起凝血酶的检测新方法。该传感器平台最低可检测出10 nmol/L的凝血酶,线性范围40-100 nmol/L。

3.1.2 适配子压电生物传感器:压电生物传感器是利用晶体的压电效应原理的一类生物传感器,Liss等[23]将IgE特异性单链DNA适配子固定在石英晶体金膜表面建立了适配子压电石英生物传感器模型,能在蛋白混合物中特异性检测IgE,最低可检测出0.5 nmol/L。实验结果表明,适配子分子小,易于在金膜表面密集固定,比传统的免疫传感器敏感度高10倍,提高了压电石英生物传感器的检测范围,而且固定在金膜表面的适配子可耐受反复洗脱,不影响其灵敏度,有利于芯片的重复利用。

Yuan等[23]利用等离子体表面共振成像与适配子技术建立蛋白质芯片,检测该蛋白质芯片上吸附的蛋白抗体凝血酶、血管内皮生长因子(VEGF)复合物。

3.2 适配子与分子信标:分子信标(molecular beacon)是近年发展起来基于荧光共振能量转移现象的检测技术。Li等[24]建立的适配子分子信标(molecular aptamer beacon,MAB)技术,用于凝血酶检测,该方法可对反应过程进行实时检测。Fang等[25]将针对血小板来源生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)B链的适配子两端分别连接荧光基团和荧光淬灭基团,可以在体液或细胞培养液中检测到pmol/L浓度的PDGF。最近研究人员将不同荧光淬灭分子对应用到PDGF检测中,取得了较好结果,为应用适配子分子信标技术同时检测多种靶分子打下了良好的基础[26]。

3.3 生物质谱

近年来,适配子又被用于MALDI—MS(基质辅助激光解吸电离质谱)法中作为蛋白质捕获和分析的工具[27]。将一个与凝血酶特异结合的DNA适配子共价结合到硅化玻璃面后,可以直接用来检测凝血酶。在和不能形成G-四聚体的乱序寡核苷酸进行对照结合实验后,发现只有特定的适配子可以捕获凝血酶。将5-50 pmol的凝血酶分别与适配子共孵育,结果表明最佳的检测范围为5-10 pmol。另外,可以使用适配子从复杂的混合体系中选择性地捕获凝血酶。

3.4 适配子技术在其他方面的应用

在双位点结合实验模式中,核酸适配子既可作为捕获分子又可作为检测分子,已成功应用于血管内皮生长因子、CD4分子、凝血酶等靶分子的检测。最近研究者尝试将适配子同时作为捕获分子和检测分子进行双位点结合实验[28]。在荧光偏振分析中,适配子分子小,与小分子靶物结合后易引起构型改变,进一步增加偏振,在非竞争性荧光偏振分析有明显优势。Fang等[29]用荧光基团标记血小板来源生长因子(PDGF)的适配子,通过荧光偏振分析实时监控适配子与PDGF的结合,可以检测到lnmol的PDGF。基于抗体流式细胞技术存在一定局限,抗体分子较大,不易进行细胞内结合,与Fc受体存在非特异性结合,适配子的应用可在一定程度解决这些问题,提高检测的可靠性,促进流式细胞术检测的推广应用。与蛋白质印迹原理相似,研究人员利用筛选出的针对金黄色葡萄球菌的适配子来检测金黄色葡萄球菌[30]。

4 前景与展望

由于SELEX技术特点突出,因而具有良好的应用前景。凡是涉及抗体的诊断领域,几乎都可以用适配子代替,特别是可以弥补抗体在诊断领域中应用的不足。在双位点结合试验模式中已有研究表明,适配子比单克隆抗体更适于难以区分的结构类似物或交叉免疫反应的鉴别诊断;在分子信标模式中,一般分子信标只能用于核酸的检测,而新建立的适配子分子信标可以用于非核酸物质如蛋白质的检测。此外,适配子在毛细管电泳、流式细胞术、荧光偏振等分析模式中都发挥着非常重要的作用;在传感器方面,与抗体介导的免疫传感器相比,适配子的特点是亲和力高、特异性强,靶分子范围非常广,且稳定性好,可快速变性、复性,能反复使用、容易制备,便于长期保存和运输。尽管适配子在生化分析领域的应用目前尚处于起步阶段,相关报道也相对较少,但相信这类应用将会越来越多。展望未来,适配子将在分子生物学、疾病预防、临床诊断、新药开发、环境监测、食品卫生检验、生物毒素检测、毒理学等领域显示更加广阔的应用前景。

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