自动分析方法测定血浆维生素C

张静春,石晓群,林 伟,荣墨克*

(1.吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春 130033;2.吉林大学中日联谊医院放疗科,吉林 长春 130033;3.吉林大学中日联谊医院 康复科,吉林 长春 130033)

自动分析方法测定血浆维生素C

张静春1,石晓群2,林 伟3,荣墨克1*

(1.吉林大学中日联谊医院 检验科,吉林 长春 130033;2.吉林大学中日联谊医院放疗科,吉林 长春 130033;3.吉林大学中日联谊医院 康复科,吉林 长春 130033)

*通讯作者

维生素C(Vitamin C,Vc)是人体内重要的水溶性氧化剂,其作用是清除体内自由基,防止及降低致病基因的突变,减少生物协同因子和基质的作用[1-3]。血清Vc的水平反映人体内生物反应的变化过程,对估价体内的营养水平有重要参考价值。Vc的测定方法有HPLC和化学法等[4,5],均不适于临床常规应用,通过应用抗坏血酸氧化酶使抗坏血酸变成脱氢抗坏血酸,与邻苯二胺呈显色反应,用自动生化分析仪,快速,准确地测定血浆Vc含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Beckman Synchron CX9自动生化分析仪。抗坏血酸(AA),抗坏血酸氧化酶(AO),邻苯二胺(OPDA),偏磷酸(MPA),二硫苏糖醇(DTT)均购自Sigma公司,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠购自北京化工厂。

1.2 试剂配制 ①蛋白沉淀剂贮存液(MPA 5.0 mol/L/DTT 51.2 mmol/L):称取MPA 400 g,DTT 800 mg加水至 100 ml;蛋白沉淀剂应用液(MPA 500 mmol/L/DTT 5.12 mmol/L):将贮存液用蒸馏水稀释10倍。②抗坏血酸标准贮存液(2.84 mmol/L):精确称取AA 50 mg,加MPA/DTT液至 100 ml;抗坏血酸标准应用液:将贮存液用MPA/DTT液稀释成283、113、56.6 和 5.68 μ mol/L。 ③磷酸盐缓冲液(0.10 mol/L):称取NaH2PO41.155 g,Na2HPO4◦7H2O 388.5 mg,加80 ml蒸馏水,调酸碱度至pH 6.5,再以蒸馏水稀释至100 ml。④抗坏血酸氧化酶贮存液(200 kU/L):按购买的AO活性单位以磷酸盐缓冲液溶解AO至200 kU/L;抗坏血酸氧化酶应用液(8 kU/L):取100 μ l贮存液以2.4 ml磷酸盐缓冲液稀释。⑤显色剂(OPDA 4.6 mmol/L/DTT 0.6 mmol/L):称取OPDA 50 mg以磷酸盐缓冲液溶解至100 ml,调pH 6.5,加 DTT 9.25 mg,混合溶解。

1.3 方法 ①标本采集及处理以肝素抗凝真空采血管取静脉血3 ml,放置10 min,分离血浆,取血浆500 μ l加MPA/DTT 液 50 μ l。混合 30 s,1500转离心10 min,取上清液待用。

②仪器操作1)装试剂将抗坏血酸氧化酶应用液装入试剂盒的C瓶中,将显色剂装入试剂盒的A瓶中。2)Beckman Synchron CX 9自动生化分析仪维生素C测定操作参数设定见表1。

2 结果

2.1 方法的精确性 取浓度为114 μ mol/L和28.3 μ mol/L高低两种的AA标准品各30份,作精确性试验,批内变异分别为:5.2%和4.5%。批间变异分别为:7.6%和4.1%。

2.2 方法的准确性 取浓度分别为5.68 μ mol/L、56.6 μ mol/L 、113 μ mol/L 、170 μ mol/L 、283 μ mol/L 的AA标准品,加入血浆中,测定其回收率,结果分别为 :95.4%、95.6%、96.1%、102%、106%。

2.3 方法的线性 取浓度分别为5.68 μ mol/L、56.6 μ mol/L 、113 μ mol/L 、170 μ mol/L 、283 μ mol/L 的AA标准品作线性测定,浓度为 5.68 μ mol/L-283 μ mol/L间有良好的线性关系,其直线方程为y=1.021 x+0.003,r=0.998。

表1 CX9自动生化分析仪Vc测定参数

2.4 干扰性试验 取血浆分别加入胆红素800 μ mol/L 、1600 μ mol/L;甘油三脂 10 g/L 、20 g/L;血红蛋白1.5 g/L、3.0 g/L。胆红素和甘油三脂对Vc结果没有影响,血红蛋白1.5 g/L时对结果没有影响,当浓度为3.0 g/L时使结果偏低15%。

2.5 参考值范围 选取体检健康成人50名,男35名,年龄23-57岁。女15名,年龄25-52岁。其参考值范围为:29.1-92.3 μ mol/L。

3 讨论

常用的Vc测定方有HPLC法和显色法,前者的特异性和准确性较好,但用时较长,不适合临床常规应用;后者特异性和准确性较差,且预处理时间亦很长。两者都不能应用自动分析方法快速测定。我们采用AO将Vc氧化生成DHAA,后者与OPDA反应,应用BeckmanSynchron CX9自动生化分析仪测定,该仪器通过应用程序的设定可自动标定标准,自动测定空白,并自动计算出结果。本法简便,快速,准确,可用于血浆和尿液的测定,适于临床常规应用。

显色剂OPDA除了与DHAA反应,还与其它的氧化型物质反应,因此,在自动分析中先将血浆与OPDA反应作为空白测定,然后加入AO,再测定氧化后的DHAA,结果减去空白得到Vc含量。因血中的AA和DHAA同样具有生物活性,空白中除了排除了干扰物质,同时也排除了血浆中原有的DHAA,因此,该方法测定的只是AA,不包括DHAA。由于血中的DHAA只占总AA的5%左右,故不影响临床意义。

由于Vc强还原剂在空气中极易氧化,应以真空采血管取血,然后立即送检,离心后加入蛋白沉淀剂和稳定剂。为准确测定稳定内环境的Vc,应于晨空腹采血。尿液Vc测定将尿液稀释5倍同血浆测定。

诊断Vc缺乏的较为准确的试验为Vc饱和试验,即口服或静脉注射一定量的Vc,于一定的时间留取尿液,测定其Vc的含量。该方法有很多测定方式,其Vc的用量和尿液留取的时间均不同,由于尿液的留取过程容易造成Vc成份的变化,故尽量缩短留取尿液的时间,较为理想的Vc饱和试验为:静脉注射Vc 0.5 g,于4小时留取尿液,排出量为40%为正常。排出量20%以下为缺乏。

[1]李美茹,刘秀芬.维生素C的作用[J].生物学教学,2006,31(10):75.

[2]朱长林,张文彬,孙 鹏,等.维生素C与维生素E的联合免疫调节及抗氧化作用[J].中国临床康复,2006,10(36):120.

[3]刘玉香,杜青平,孟紫强.SO2致CHL细胞氧化损伤及VC保护作用[J].中国公共卫生,2007,23(2):229.

[4]莫海涛,杜玉兰,黎庆涛,等.反相高效液相色谱法测定发酵饮料中有机酸和维生素C的含量[J].食品工业科技,2007,2:230.

[5]李秋菊,王亚红,刘秀萍.维生素C测定方法[J].太原师范学院学报(自然科学版),2005,4(1):89.

1007-4287(2010)01-0140-02

张静春(1965-),男,主管技师,从事临床生化检验及研究工作。

2009-01-06)