阴沟肠杆菌的Ⅰ类整合子检测及相关耐药基因分析

李 岩,苏建荣,许淑珍,刘志远

(首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心,北京 100050)

阴沟肠杆菌的Ⅰ类整合子检测及相关耐药基因分析

李 岩,苏建荣,许淑珍,刘志远

(首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心,北京 100050)

目的对临床分离的阴沟肠杆菌进行Ⅰ类整合子及相关耐药基因分析,探讨I类整合子与阴沟肠杆菌耐药播散的关系。方法使用Vitek-AMS鉴定细菌;采用PCR扩增技术对86株阴沟肠杆菌进行Ⅰ类整合子与ESBLs耐药基因型检测;Ⅰ类整合子与耐药基因水平传播采用质粒接合试验;根据CLSI指南进行药敏试验。结果86株阴沟肠杆菌中,77.9%的阴沟肠杆菌携带不同大小的整合子,从1 500 bp整合子中检出的耐药基因盒包括:aadB、aadA2;2 500 bp整合子中检出PSE-1、aac6-Ⅱ、aadA4基因盒。结论阴沟肠杆菌中常携带含有多种耐药基因的Ⅰ类整合子,Ⅰ类整合子常参与耐药基因在菌株间进行的水平传递。

阴沟肠杆菌;Ⅰ类整合子;耐药

(Chin J Lab Diagn,2010,14:1356)

整合子是近年来发现的一种天然的表达和克隆载体,具有强大的基因捕获、移动和表达能力,目前已有4类整合子得到了确定。而在大多数临床分离株及革兰阴性杆菌中存在着1类整合子。本文对临床分离的阴沟肠杆菌携带的Ⅰ类整合子及相关耐药基因进行分析,以期探讨Ⅰ类整合子与耐药基因在阴沟肠杆菌菌株间的播散特点与机制。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

选取2006年1月至2006年10月间,我院住院患者痰、尿、伤口引流物等标本中分离的阴沟肠杆菌86株。全部菌株均通过Vitek-AMS鉴定。

质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922,铜绿假单孢菌ATCC27853,肺炎克雷白菌ATCC 700603(产SHV-18)。经PCR扩增与DNA测序证实的携带有TEM-1、SHV-12、CTX-M-3、CTX-M-9 基因以及 Ⅰ类整合子的阴沟肠杆菌,作为聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)的阳性参考菌株,阴沟肠杆菌029作为PCR反应的阴性参考菌株。

质粒接合试验菌株 供体菌(donor)为携带ESBLs耐药基因的阴沟肠杆菌。受体菌(recipient)为大肠埃希菌ECO-600(萘啶酸耐药NAlR,利福平耐药RifR,不携带质粒F-,不发酵乳糖lac-)。

1.2 抗菌药物与药敏纸片 抗菌药物包括,头孢他啶(CAZ)、头孢噻肟(CTX)、环丙沙星(CIP)、氨曲南(ATM)、利福平(Rif)购自中国生物制品研究所。左旋氧氟沙星(LVX)购自北京双鹤药业股份有限公司。

1.3 培养基 羊血琼脂平板购自天津金章公司。M-H琼脂为英国Oxoid公司产品。质粒接合试验选择性培养基,参阅文献[1]。

1.4 药敏试验 琼脂稀释法(MIC法),按照CLSI指南进行操作和判读结果。

1.5 PCR试剂 引物合成,PCR试剂和DNA分子量标准,均由北京赛百盛公司提供。

1.6 ESBLs耐药基因检测

PCR引物设计、反应体系与条件参阅文献[1]。

1.7 Ⅰ类整合子相关耐药基因盒扩增

根据Ⅰ类整合子可变区两侧的高度保守序列设计引物[2],(in-F 5′-GGCATCCAAGCAG CAAG-3′和 in-B 5′-AAGCAGACTTGACCTGA-3′)进行 Ⅰ型整合子可变区PCR扩增。

PCR扩增条件:反应体系为50 μ l,含有10×PCR反应 buffer,200 μ MdNTPs,引物各 10 μ M,1 UTaqDNA聚合酶。整合子扩增条件为:95℃变性10',然后95℃1'→55℃2'30”→72℃1',30个循环,最后 72℃延伸10'。

1.8 PCR扩增产物鉴定与序列分析 参阅文献。

1.9 质粒接合试验 参阅文献[1]。

2 结果

2.1 Ⅰ型整合子PCR扩增结果

对86株阴沟肠杆菌进行Ⅰ类整合子可变区基因扩增,发现多种不同长度的整合子可共同存在于阴沟肠杆菌中,扩增片断大小从150 bp到2 500 bp不等。86株细菌中整合子PCR扩增阳性67株,占77.9%。其中42株ESBLs多重耐药菌株:整合子扩增阳性率占88.1%(37/42);主条带＞1 000 bp者76.2%(32/42)。44株非ESBLs菌株(含AmpC酶阳性菌株)整合子扩增阳率占52.3%(23/44)。主条带出现在 ＞1 000 bp者11.3%(5/44)。

2.2 ESBLs阳性菌株与其接合子中整合子PCR扩增产物电泳谱特点

对6株接合试验阳性接合子进行了整合子扩增,并与供体菌的整合子电泳图谱进行比较,其中4株供体菌(12号、28号、48号、34号)在接合试验中,将其整合子转入受体菌。而2号菌株为ESBLs阳性菌株(接合实验未成功),其含有大小约150 bp、300 bp、2 500 bp的整合子扩增片断。

图1 部分ESBLs阳性菌株与其接合子中整合子PCR扩增产物电泳谱

2.3 整合子扩增产物序列分析

选取不同大小的PCR产物,进行纯化后克隆测序 。其中,约2 500 bp、1 500 bp、450 bp 大小的PCR扩增片断测序成功。450 bp整合子结构中插入基因盒为mobB;1 500 bp整合子结构中插入基因盒为aadB,aadA2;2 500 bp整合子结构中插入基因盒为aacA4,aac6-II,PSE-1。

3 讨论

细菌耐药性的迅速蔓延及扩散,给临床感染性疾病的治疗带来了极大的副作用。在耐药基因扩散的机制中,耐药性质粒及转座子在其中起着重要的作用。近年来,第三种耐药基因的扩散机制已被发现,即整合子(integron),一种通过特异重组位点介导耐药基因整合的DNA元件。其中,Ⅰ类整合子的结构最为完整,由5'和3'保守端及中间的可变区组成。在可变区中可含有插入基因,而插入的基因包含着被叫做基因盒(gene cassette)的可移动元件,大多数都表达耐药性。迄今为止,至少70种不同的耐药基因盒已被发现,它们在种内及种间转移,使宿主菌成为广谱耐药性细菌。

对我院分离的阴沟肠杆菌整合子检测发现,Ⅰ类整合子PCR扩增阳性77.9%。ESBLs菌株Ⅰ类整合子扩增阳性率88.1%,主条带 ＞1 000 bp者占76.2%。非ESBLs菌株Ⅰ类整合子扩增阳性率占52.3%,11.3%主条带 ＞1 000 bp。这说明,Ⅰ类整合子在阴沟肠杆菌中普遍存在,并可以多克隆形式存在,而在产ESBLs菌株中,其整合子内的插入基因可能更为复杂。整合子的存在无疑是阴沟肠杆菌可以不断摄取新基因并进行水平播散的重要条件基础。

通过对整合子可变区序列分析发现,不同长度的整合子扩增片段所含有的耐药基因盒有所不同。450 bp长度的整合子中含有mobB。1 500 bp整合子中含有aadB,aadA2两种基因盒。2 500 bp整合子中含有PSE-1,aac6-Ⅱ,aadA4基因盒。

其中 aadB 、aadA2、aac6-II、与aacA4基因盒为耐氨基糖苷类抗生素的相关耐药基因。而PSE-1基因则为β-内酰胺类耐药基因,其编码PSE-1蛋白,可造成细菌对氨苄西林、羧苄西林、头孢噻酚、头孢孟多和派拉西林的耐药。可见,Ⅰ类整合子在阴沟肠杆菌β-内酰胺类耐药机制中也扮演了重要角色。在阴沟肠杆菌携带的Ⅰ类整合子中检出β-内酰胺类耐药基因在国内未见相关报道。

耐药性的产生主要是通过自身基因的突变积累,或者在水平方向上获取耐药性基因。整合子被认为是耐药基因水平传播的重要因子。整合子本身无法进行转移,他们常常出现在转座子及接合性质粒上,而这些转座子又常常位于质粒上,这种情况提高了耐药基因盒扩散的能力[3,4]。本研究也表明,Ⅰ类整合子在阴沟肠杆菌相关耐药基因的播散中发挥了重要作用。

[1]李 岩,许淑珍,苏建荣,等.阴沟肠杆菌喹诺酮耐药基因的检测[J].中华医院感染学杂志 2008,18(4):474.

[2]Papanicolaou G A,Medeiros A A,Jacoby G A,et al.Novel plasmidmediated β-lactamase(MIR-1)conferring resistance to oxyimino-and αmethoxy β-lactams in clinical isolates of Klebsiella pneumoniae[J].Antimicrob.Agents Chemother,1990,34:2200.

[3]Ceccarelli D,Salvia A M,Sami J,et al.New cluster of plasmid-located class I integrons in Vibrio cholerae O1 and a dfrA 15 cassette-containing integron inVibrio parahaemolyticus isolated in Angola[J].Antimicrob A-gents Chemother,2006,50(7):2493.

[4]Dubois V,Poirel L,Marie C,et al.Molecular characterization of a novel class 1 integron containing bla(GES-1)and a fused product of aac3-Ib/aac6'-Ib'gene cassettes in Pseudomonas aeruginosa[J].Antimicrob A-gents Chemother,2002,46(3):638.

Analysis of drug restance genes in tegrated by classⅠintegron in clinical Enterobacter cloacae isolates

LI Yan,SU Jianrong,XUShu-zheng,et al.(Clinical laboratory center,Beijing Friendship Hospital,Capital University of Medical Sciences,Beijing100050,China)

ObjectiveTo study distribution of the classⅠintergron in clinical Enterobacter cloacae isolates.MethodsE.cloacaewas identified by Vitek-AMS;Detection of class Ⅰ intergron and Extended-spectrumβ-lactamases(ESBLs)resistant genes were performedby PCR.Plasmid conjugation testwas used to determine the transmission of classⅠintergron.The antibotic susceptibility of Enterobacter cloacae was detected according to the CLSI guideline.ResultsThe incident rate of Enterobacter cloacae with classⅠintergronwas77.9%in 86strains.Sequencing data of integrons revealed that amplicon 1500bp harboredgenesof addB and aadA2,amplicon 2 500 bp harbored genes of PSE-1、,aac6-II、,aadA4.ConclusionEmergence of class Ⅰ integrons are frequent in E.cloacae,which usually harbor several different drug-resistant gene casettes.Drug restance genes in tegrated by classⅠintegron were widespread in clinical Enterobacter cloacae isolates.

Enterobacter cloacae;classⅠintergron;Drug resistance

R372

A

1007-4287(2010)09-1356-03

2009-12-20)