现代分子生物学技术对微生态群落的研究进展

高传庆 张钧利 潘康成

（①山东省滨州市畜牧兽医局 256600 ②江苏无锡阿尔宝尔生物工程有限公司③四川农业大学动物医学院 动物疫病与人类健康四川省重点实验室）

动物消化道内的微生物群落是一个极其复杂的生物群体，包含有超过400种的细菌类别，其数量随年龄、环境等条件的变化而产生变化。传统的微生物群落多样性及结构分析是以纯培养技术为基础，通过微生物形态及生理生化特征等表型分析。目前，由于受到培养条件的限制，只能培养与鉴定出约20%～40%的细菌，对这些存活但不可培养的微生物研究成为制约微生态学发展的瓶颈。另外，传统的分离计数也难以满足对微生物群落结构变化进行动态监测的需求。分子微生态学依据样品中微生物核苷酸序列的不同，分析其种类和相对数量，揭示微生物种类组成以及种群数量情况，从而对微生物群落结构得到一个比较客观、全面的认识。这种研究方法不受纯培养的限制，而且速度快、提供的信息量大，因而特别适合于对消化道微生物群落结构进行连续动态分析，达到解析群落结构与功能关系、实现对群落功能定向调控的目的。

1 荧光原位杂交技术

FISH是根据16S或23S rRNA上相应于特定微生物类群的特异性序列设计专一性探针，对样品进行全细胞荧光原位杂交，利用荧光显微镜对所标记的细胞进行观察和计数的一种微生物分析技术，该技术建立在敏感度极高、不同颜色荧光标记基础上的原位分析法。这种杂交方法的目标rRNA主要存在于活细胞中，因此可以对特定类群的微生物活细胞进行定量描述。目前该技术多用于环境中特定微生物种群鉴定、种群数量分析、特异微生物跟踪检测、微生物的空间定位等。Asfie等用该技术研究金鱼排泄物菌群结构的组成，发现气单胞菌属是金鱼消化道的主要菌群。Salzman等利用FISH技术检测小鼠肠道菌群，结果有25%的菌群序列为已描述的细菌，75%为未描述的新细菌序列，通过设计的探针与结合其它方法可以确定大约80%的大肠内细菌和71%的盲肠细菌。Kenji等研究大鼠口服乳酸菌后采用FISH检测鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌和植物乳杆菌数量变化，结果，口服乳酸菌后的这些细菌数量在肠道中得到升高，而给予葡聚糖后的大鼠发生腹泻和这些细菌数量大量下降。

虽然FISH技术在环境样品中微生物多样性、污水处理相关微生物多样性、内共生微生物多样性以及医学微生物口腔、肠胃、呼吸道菌群多样性研究中得到了广泛的应用，但该技术的应用要受到环境样品微生物生理状态的影响，如芽孢、放线菌及休眠时期细胞的细胞膜通透性降低、以及细菌在繁殖过程中荧光基因可能发生变化的情况都会影响群落中部分种属丰度的正确估计，而且不能检测出环境样品中的未知种属。再则，FISH技术定量的手段还停留在荧光显微镜下的人工计数阶段，这不仅费时，而且杂交细胞的数量仅限于几千个，数量有限，微生物定量的准确性依赖于样品的处理和多个视野计数的平均，这些因素限制了它的广泛应用。

2 脉冲场凝胶电泳

PFGE的基本原理是利用电泳脉冲系统通过琼脂糖凝胶分离大片段的DNA，即用限制性内切酶将分离物的基因组消解成相对小的大片段后，用脉冲场凝胶电泳将它们分开，从而获得DNA片段的指纹图，通过计算机凝胶扫描、软件分析，建立对所有微生物的PFGE图谱的数据库，以便各菌株间的比较。该技术可以分离大小为50～1000 kb的DNA片段，甚至可以观察整个染色体，可用于分离细菌染色体等大分子DNA。PFGE已经成功的应用于分析不同细菌中的染色体构成，同时结合特异性的酶切技术用于菌种间或同一菌种不同菌株的鉴定。此外，它还可以为判断基因组的大小和基因图谱的建立提供有用的资料。PFGE对特异的菌有特征性，步骤简单，具有高分辨力，且结果易于分析。Kimura等应用此技术对人粪便样品检测结果发现，在人的粪便中乳杆菌和双歧杆菌为主要菌群。O’Riordan等应用PFGE结合限制性酶用于双歧杆菌种间及菌株间的鉴定，尽管PFGE技术在菌株间的鉴定具有很大的潜力，但对细菌菌株的分类鉴别是没有价值的。该技术耗时较长，一般需要5d～7d才能完成，这样大大降低了实验室分析大量样品的能力，使其应用受到限制。

3 ERIC-PCR技术

1990年，Sharples等在对E. coli基因组进行分析时，首次发现了ERIC片段，名命为“基因间重复单位”序列（IRU）。随后，Hulton等研究发现肠杆菌基因间也有这样的保守重复序列，并命名为Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus (ERIC)，ERIC的中心有段保守性很高的反向重复序列，该序列长约44bp。Versalovic等以ERIC的核心序列设计一对反向引物，认为ERIC-PCR扩增是两个相邻的ERIC保守序列之间的区域，由于不同的细菌基因组上的ERIC重复序列的数目和分布不同，从而得到一系列大小不同片段组成的DNA指纹图谱，并将该技术申报专利。此后，ERIC-PCR技术被广泛用于细菌分类和菌种鉴别上。该方法可直接根据样品ERIC条带的分布、数量和亮度等信息去分析肠道样品中菌群结构和种群变化，该法快速、简洁、不依赖纯培养。Di Giovanni等首次报道将ERIC-PCR应用到混合菌群群落结构的分析研究上，得到能反映菌群组成差异的重复性好且稳定的指纹图谱，在研究混合菌体系时，发现相对于RAPD方法，更稳定，重复性更好，而且具备RAPD不要求模板序列已知而直接进行扩增的优点。目前该技术被广泛应用于检测人和动物的肠道菌结构和多样性。由于ERIC-PCR之后都采用琼脂糖进行电泳分析其条带，其电泳分辨率较低，在不同系统中有很多条带具有相同的电泳特性但其序列组成信息不同，可能造成一些肠道菌群的漏检，Yang等进行ERIC-PCR后采用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析，可显著提高其分辨率。

4 PCR-DGGE方法

DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)是利用序列不同的DNA片段解链温度不同的原理，通过梯度变性胶将DNA分离开来的电泳系统。在含有尿素和甲酰胺的浓度线性递增的聚丙烯酰胺凝胶电泳中，部分解链的双链DNA分子的电泳迁移率下降。在双链DNA分子中，AT碱基之间有2个氢键，而GC之间有3个氢键，因此AT碱基对变性剂的耐受性低于GC碱基对。由于这四种碱基的组成和排列差异，使不同序列的双链DNA分子具有不同的解链温度。在电场的作用下，当某一双链DNA序列迁移到变性凝胶的一定位置，并达到其解链温度时，即开始部分解链，解链程度越大，迁移阻力越大，DNA分子的迁移速度随之减小，产生的迁移阻力与电场力相平衡时，具有不同序列的DNA片段则停留于凝胶的不同位置，结束电泳时，形成相互分开的条带图谱。

DGGE最早由Fischer和Lerman发明，并用于检测DNA突变。Muyzer等首次用于分析土壤环境的微生物区系以来，DGGE已成为检测环境微生物群落多态性的一种可靠方法。用DGGE进行微生态研究时，根据细菌16Sr RNA基因序列中可变区的碱基顺序，选择与可变区（如V3或V6-V8区）配对的引物，扩增出细菌16S rRNA基因的部分序列，并通过DGGE得到分离，电泳条带的数目、位置和强度可辨别出样品中微生物的种类及细菌的相对构成比例，得出不同样本的微生物结构及组成。为了使目的序列能够完全解链，在PCR扩增目的片段时，在引物的一端人为掺入一段约40个碱基的GC序列用以调节目的序列的解链行为，可使对核酸片段序列差异的敏感度提高1倍。

PCR-DGGE技术本身的局限性不容忽视，例如核酸提取的片面性、PCR反应过程中形成的16S rDNA嵌合体序列及PCR反应中对某些序列的优势扩增等。另外，DGGE只能分离较小的DNA片断(达500bp)，较长的片断分离率下降，限制其用于系统发育分析和探针的序列信息数量，DGGE只能给出定性的结果，必须结合FISH进行微生物的确认和定量。理论上，只要选择的电泳条件如变性剂梯度、电泳时间、电压等足够精细，最少可检测到只有一个碱基差异的DNA片段，但是DGGE法并不能对样品中所有的DNA片段进行分离，在微生物群落中数量小于1%的种群不能很好地进行分析；此外，不同的DGGE实验条件很可能导致不同的带型谱图，这无疑对序列信息的探针设计和系统发育分析也有一定的影响。尽管DGGE技术具有以上局限性，但因其重现性强、可靠性高、速度快，可同时检测多个样品，能用于对微生物的动态跟踪观察，且可以对特定条带测序或利用探针杂交方法进一步分析，能够弥补传统方法分析微生物群落的不足，已逐渐成为现代分子微生态学领域一种重要研究手段，并被广泛应用于检测动物肠道中的菌群结构和菌群的多样性。

5 实时荧光定量PCR

RT-qPCR 是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。RT-qPCR技术最早由Higuchi提出，当时设想实时观察PCR反应的全过程，最终达到检测样品中的DNA量的目的。1995年美国PE公司成功研发了TaqMan技术，1996年又推出了首台Real-time PCR检测系统，使该技术得以应用和推广。RT-qPCR的化学原理包括荧光探针类和荧光嵌合类两种。荧光探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，如Taqman探针、复合探针、分子信标、双杂交探针等，其中以前两者最为常用。TaqMan探针法中所用TaqMan探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。探针的5'末端连接报告荧光基团FAM（6-羧基荧光素），而3'末端则连接淬灭荧光基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。当完整的探针与目标序列配对时，两基团之间构成共振结构，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭。但在进行PCR延伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针进行酶切，破坏了两基团间的共振结构，使得荧光基团与淬灭基团分离，荧光信号得以释放，从而荧光监测系统可接受到荧光信号。DNA模板每复制一次，就有一个探针被水解，并释放出荧光信号，理论上被释放的荧光基团数目与PCR产物数量是一对一的关系，光密度同释放的荧光基团数目成正比关系，因此对模板达到了准确定量。目前，RT-qPCR的Taqman探针技术被认为是肠道菌定量的“金标准”。

该技术是对常规PCR技术的革新，其定量和扩增同步进行克服了PCR的平台效应；除加样开盖外，其后完全是闭管操作，减少污染；不需PCR后处理，避免假阳性；可直接监测扩增中荧光信号变化获得定量结果，精确性和灵敏度高；检测速度快，几个反应可同时进行，多色荧光检测；特异性和重复性强；应用范围广。经典的肠道菌群检测方法只是检测可培养的优势菌群，而RT-qPCR技术，还可以检测不可培养的菌群，并且可以通过进一步的定量分析来确定在具体肠道某一类有益菌和有害菌在肠道的定植规律，以及更深入研究它们对动物健康状况的影响。RT-qPCR技术能直接采用从粪便样品中提取的细菌DNA来定量肠道中的优势菌群和非优势菌群。因此，近年来，以16S rDNA基因为基础的RTPCR已被成功用于肠道菌群结构及细菌定量、病源检测、基因表达分析等多个领域的研究，并日益显出了它的优越性。

6 结束语

上述几种分子生物学方法已经建立了比较成熟的技术，每一类方法都有自身的功能和局限性，也都在发展和完善当中，并相互补充相互推动。传统培养分离方法积累了种群分类的大量数据，为生物标记方法和现代分子生物学技术提供了良好的背景材料，在功能特性的认识上有独特的优势。生物标记方法可快速进行单个环境微生物样品的群落结构和多样性解析，但在定性上依赖于传统培养分离方法。现代分子生物学提高了解析的灵敏度，在基因水平上扩大了物种多样性的视野，其中基因指纹技术可同时分析多个样品，直观显示了种群结构变化情况，有助于分析调控因子对群落结构和群落功能的影响。 分子生物学技术的发展使微生物多样性研究更直接，也给肠道微生物研究展示了一个革命性的前景。每种方法有各自的应用特点，在肠道微生态的研究中，应该根据不同的研究对象，采取不同的分子生物学方法或联合应用几种方法才可能对肠道菌群有一个更全面的了解。