饲用植酸酶的研究进展

马俊孝

植酸的化学名称为肌醇六磷酸酯（myo-inositol hexakisdihydrogen phoshate），即环己六醇的六磷脂，几乎不以游离形式存在，一般是以其钙、镁、钾、钠、铁等金属离子结合形成复合物，这些复合物不溶于水，不能被消化吸收，还能螯合蛋白分子，降低蛋白质的生物效价和消化率，是一种广谱性的抗营养因子。玉米、豆饼粕、谷糠、棉籽饼粕等是畜禽饲料的主要来源，其中所含的磷40%～70%以植酸磷的形式存在。单胃动物消化道内缺乏分解消化植酸的酶，一方面饲料中需要补充无机磷；另一方面饲料中大量的植酸磷不能被利用而随粪便排入环境，既浪费了资源，又对环境造成了污染。植酸酶是一种能水解植酸的酶类，在提高磷的利用率、减少粪便中有机磷的排放以及降低饲料成本方面的效果已被广泛证实[1-2]。因此，植酸酶的研究与开发具有重要的理论与实践意义。植酸酶在天然材料中的产量很低，酶的耐热性不能完全满足饲料的加工过程，酶在动物消化道环境中的稳定性也亟待提高。近年来，应用分子生物学手段对这些问题进行了大量的研究并取得了一系列成果，本文介绍了这方面的研究进展。

1 植酸酶的来源

植酸酶在自然界的分布很广泛。小麦、大豆、玉米、大麦、番茄以及百合等多种植物都能产植酸酶，但只有少数的植物植酸酶被分离纯化并进行了酶学性质研究。自然界里许多微生物都可以产生植酸酶，已陆续从细菌、真菌及酵母等多种微生物中分离得到植酸酶，其中植酸酶产量最高的是真菌，其产生的植酸酶有pH值范围广、活性高等优点，是生产商品植酸酶的主要来源[3-4]。动物源的植酸酶存在于哺乳动物的小肠及脊椎动物的红血球中，此外，牛等反刍动物的瘤胃中植酸酶活性较高，这可能是瘤胃中的微生物可以产生植酸酶的缘故。动物来源的植酸酶含量少且活性低，很难进行分离纯化和性质分析，因此，人们对动物来源的植酸酶研究较少。

2 植酸酶的生物学特性

植物植酸酶活性的最佳pH值范围窄，不适合在单胃畜禽酸性的胃中起作用[5]，最适温度在47～62℃[6]。植物植酸酶分子量变化较大，分子量较小的有米糠植酸酶，为47 kD；分子量较大有绿豆植酸酶，达158 kD。

微生物来源的植酸酶，其性质因产酶菌种不同而存在差异。最适pH值范围较宽，一般在2.5～6.0，有的菌株所产的酶具有两个最适pH值峰值，比较适合单胃畜禽的胃肠道环境。比如无花果曲霉（Aspergillu ficuum NRRL3135）的植酸酶，它的最适pH值为2.5和5.5[7]。分离自百合（Lilium longiflorum）的植酸酶，其最适pH值为7.3～8.3，它是迄今发现的极少数的碱性植酸酶之一[8]。大部分微生物植酸酶的最适温度都集中在40～70℃之间，微生物植酸酶因来源不同分子量也有差异。

3 植酸酶基因

目前克隆到的植酸酶基因主要有：真菌来源的phyA(B)基因、芽孢杆菌来源的phyC(L)基因、大肠杆菌来源的appA基因、其它微生物来源及动植物来源植酸酶基因。

对植酸酶基因研究较多的是来源于真菌的phyA(B)基因，表达产物几乎全为酸性植酸酶。Van Hartingsveldt等（1993）首次报道了来自A.ficuum NRRL3135的植酸酶基因phyA[9]，该基因全长1 506 bp，其中+46～+147的102 bp的核苷酸序列是一个典型的真菌内含子，具有真菌内含子的特征保守序列。phyA基因编码467个氨基酸，有数目不等的潜在的糖基化位点，N端的19个氨基酸为信号肽。phyA编码的氨基酸序列上存在组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列，可归为组氨酸酸性磷酸酶这一家族。phyA基因中G+C含量达68.3%，这是丝状真菌中表达蛋白编码序列所具有的特征之一，无论是在核苷酸来源及所编码的氨基酸的序列还是在基因产物的酶学特征上均具有较高的同源性。同年，Ehrlich等分离克隆来自A.ficuum的第二个植酸酶基因phyB，phyB与phyA的核苷酸序列及所编码的氨基酸序列同源性低，但表达的蛋白属组氨酸酸性磷酸酶家族，氨基酸序列上也有活性位点保守序列，phyB基因全长1 605 bp，共编码479个氨基酸，其上至少有8个糖基化位点，phyB编码的植酸酶最适pH值为2.5，而phyA植酸酶的最适pH值为5.0[10]。

来源于细菌（主要是芽孢杆菌，Bacillus subtilis）的植酸酶多为中性植酸酶，没有组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列，基因较短，与已报道的phyA及phyB同源性低，不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。Kerovuo等（1998）首次从B.subtilis VTT E-68013中分离出植酸酶基因phyC，该基因全长1 152 bp，编码383个氨基酸，其中N末端的26个氨基酸是信号肽序列[11]。各种芽孢杆菌植酸酶的酶学性质基本一致，具有相近的分子量和等电点，都具有较好的热稳定性和相近的最适pH值范围。

来源于大肠杆菌的植酸酶(appA植酸酶)是一种双功能酶，在酸性条件下既表现出磷酸酶的活性又表现出植酸酶的活性。appA植酸酶是迄今所知的分解植酸能力最强的植酸酶[12]，也是迄今所报道的比活性最高的植酸酶[13-14]。Greiner等（1993）从 E.coli中克隆得到植酸酶基因appA，appA是一个编码双功能蛋白基因，全长1 299 bp，编码432个氨基酸，N末端22个氨基酸为信号肽。按成熟蛋白的氨基酸推断，其理论分子量为45.7 kDa，有2个潜在的糖基化位点，氨基酸序列上存在活性位点保守序列[15]。

Huang等（2006）从中间型耶氏菌（Yersinia intermedia）中克隆得到一个新的植酸酶基因，该酶基因全长1 326 bp，编码441个氨基酸，氨基酸序列上存在活性位点保守序列，N末端23个氨基酸为信号肽，与肠杆菌、丝状真菌来源的植酸酶在空间结构上基本一致[16]。反刍动物能有效利用植酸磷，与瘤胃中的微生物产植酸酶有关，目前已经分离到多种产植酸酶的瘤胃微生物[17]。

植物中最早分离出来的植酸酶基因是来自玉米的phyS11，是Maugenset等于1997年从萌发的玉米种子中分离得到的，该基因全长1 167 bp，编码388个氨基酸，它所编码的氨基酸序列与丝状真菌只有33个氨基酸同源序列，其中有活性位点保守序列存在[18]。

4 植酸酶基因工程

4.1 在微生物中的表达

4.1.1 在大肠杆菌中的表达

在原核生物中表达外源基因研究最多的是大肠杆菌。Phyillippy等(1997)将Aspergillus niger的植酸酶基因phyA克隆到大肠杆菌中，表达出了没有被糖基化并且没有活性的胞内蛋白，在体外其活性只有天然植酸酶活性的1%[19]。姚斌等（2001）将来源于B.subtilis的植酸酶基因在大肠杆菌中进行了表达，得到了大小约为40 kD的蛋白，具有正常的生物学活性，但酶活不到理论值的5%[20]。上述研究获得的表达水平还很低，大肠杆菌中表达的植酸酶无转录后修饰，主要以包涵体的形式存在，没有酶活性，因此不适于植酸酶基因的表达。黄敏等（2009）将大肠杆菌植酸酶appA基因重组于表达载体pET32a中，导入大肠杆菌Origami(DE3)，该酶的比活力高达 3.36×106U/mg，具有非常好的抗胃蛋白酶水解的能力和部分抗胰蛋白酶水解的能力[14]。

4.1.2 毕赤酵母中的表达

毕赤酵母表达系统在技术上非常成熟，表达异源蛋白时具有诸多的优点，已成功表达了几十种蛋白。近年来，植酸酶基因在毕赤酵母中的表达取得了可喜的成绩。姚斌等（1998）对来源于Aspergillus niger 963的植酸酶基因phyA2进行了改造，然后融合到毕赤酵母高效表达载体pPIC9并转化毕赤酵母（P.pastoris GS115），表达量比原菌株高约3 000倍，表达产物具有正常的生物学活性[21]。Chen等（2004）通过优化培养基，在宿主甲基营养型毕赤酵母（P.pastoris KM71）中表达了来自大肠杆菌的植酸酶基因appA，酶的表达量提高了16～24倍[22]。

4.1.3 在其它微生物中的表达

Berka等(1998)对来源于耐热真菌高温疏绵毛菌的编码胞外植酸酶的phyA基因在镰刀菌中实现异源表达，表达的重组酶蛋白具有广泛的pH值范围，在pH值3.0～7.5内都有催化活性，在75℃仍保持酶活，在65℃（最适温度）时表现出非常优越的催化效率[23]。在枯草芽孢杆菌中已经建立了一个大规模表达植酸酶的高效的表达系统[24]。此外，在酿酒酵母[25]、乳酸菌[26-27]中成功表达了有活性的植酸酶。

4.2 在植物中的表达

转基因作物除了提供人类赖以生存的粮食和衣料等以外，还能产生各种重要物质。过去只能用微生物发酵来生产植酸酶，如果在一些植物性饲料（如玉米、大麦、大豆等）能累积足量的植酸酶，无疑是一条生产植酸酶的途径。近年来研究人员致力于将植酸酶基因导入植物中的研究，并获得了成功。目前，已在烟草[28]、大豆[29]、油菜[30]和水稻[31]等转基因植物中表达出植酸酶，有些酶能抵制胃蛋白酶的降解，而且也有一定水平的表达量，有着大规模生产的潜力。

4.3 在动物中的表达

目前，还有将E.coli的植酸酶基因（appA）导入小鼠唾液腺，使该酶基因在小鼠唾液腺中高效表达，以此作为控制环境污染的模式，结果表明，在唾液腺中植酸酶的表达能使小鼠粪便中磷的排泄量减少11%[32]。王文兵等（2003）将从A.niger 963克隆并改造后的植酸酶基因在家蚕-杆状病毒系统中进行了表达，在家蚕的蚕体和蚕蛹中表达活性分别为4.67×105U/ml血淋巴液和5.997×105U/ml血淋巴液，酶活性的最适温度范围是50～60℃，最适pH值为5.5～5.0和2.5[33]。

5 植酸酶基因工程研究的应用

5.1 提高酶的表达量

植酸酶的自然产生菌株表达量低,难以大规模低成本地生产植酸酶,采用基因工程手段可以提高酶的表达量。姚斌等（1998）构建的植酸酶的高效表达菌株，产量是出发菌株产量的3 000倍[21]。Kim等（1999）将带有来自于芽孢杆菌天然启动子的植酸酶基因克隆到芽孢杆菌表达载体pJH27强启动子BJ27的下游，在芽孢杆菌胞外分泌表达量为出发菌株产量的100倍[34]。Kerovuo等（2000）运用了一种新的芽孢杆菌表达系统，该系统与磷酸盐运输相关的pst操纵子对磷酸饥饿反应具有强烈的诱导作用。作为磷酸饥饿的结果，由pst启动子引发的表达可被诱导至5 000倍以上[35]。

5.2 改善酶的热稳定性

目前，通过基因工程菌微生物发酵来大规模廉价生产饲料用植酸酶已基本得到解决，但植酸酶在应用上的另一个关键问题始终没有得到解决，即酶的热稳定性。加工饲料都需要一个短暂的高温制粒过程，用于饲料的植酸酶必须具有良好的耐热性。对植酸酶的基因在分子水平上进行改造有利于改善植酸酶的热稳定性。

有研究表明，糖基化修饰对于植酸酶耐热性的提高是有作用的。Han等（1999）把A.niger的phyA基因在毕赤酵母中表达，得到的新植酸酶最适作用温度比原来提高了2℃[36]。

通过酶结构延伸（在酶蛋白的C末端增加一段氨基酸序列来扩展蛋白质一级结构）改变蛋白质的高级结构，可以达到改善酶理化性质的目的。陈惠等将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因重组于大肠杆菌表达载体，经PCR扩增获得结构延伸突变植酸酶基因（在植酸酶基因C端增加了来源于载体上的13氨基酸残基），重组基因在GS115酵母中表达，与野生型酶相比最适反应温度上升了3℃，75℃处理10 min后热稳定性提高21%[37]。

采用基因突变技术，改变酶活性基团DNA序列，从而改变酶蛋白的抗热性。Garrett等运用基因位点饱和突变技术 (gene site saturation mutagenesis,GSSM)将来源于E.coli植酸酶基因appA进行突变，突变株的Tm值比原酶高出12℃[38]。

5.3 改良酶的最适pH值

要使植酸酶能在畜禽体内产生有效的催化作用，要求饲用酶对声值有较大的适应范围pH值。采用基因突变技术可以改变酶的最适pH值。Andrea等(2002)通过定点突变改变真菌和同序植酸酶的pH值范围，突变株产生第2个最适pH值（在2.8～2.4）。另外，在同序植酸酶和A.fumigatus中进行突变后最适pH值降低0.5～1.0单位，而酶的比活力没有明显变化[39]。通过酶结构延伸还可以改善酶的有效pH值范围，陈惠等（2005）将来源于黑曲霉N25的植酸酶基因经结构延伸突变在酵母中表达，与野生型酶相比有效pH值范围扩大了0.4个单位[37]。

5.4 提高植酸酶对蛋白酶抗性

植酸酶主要的作用场所是动物的胃肠道，因此优良的酶应该对胃蛋白酶和胰蛋白酶有一定的抗性。酶分子易被蛋白酶降解，原因是在酶分子表面存在蛋白酶的作用位点，利用突变技术将这些位点改变，则可能提高酶分子的抗性能力。Wyss等（1999）对来源于A.fumigatus植酸酶进行突变，通过结构分析确定酶分子表面的两个位点进行突变，结果发现突变S152N、S152N/R151L可以提高抗蛋白酶降解能力而不会影响比活性[40]。James等（2001）运用基因突变技术使突变株植酸酶的肠道环境耐受性提高了35%[41]。

6 展望

用现代分子生物学技术改造和提升植酸酶产业已成为植酸酶产业化的发展方向，必将进一步提升植酸酶的性能和使用范围。它不仅符合国家产业发展的主要方向，同时也是各生产企业提高产品竞争力和取胜的关键。目前已在乳酸菌[26-27]、芽孢杆菌[24-25]、凝结芽孢杆菌[42]等用于微生态产品的菌株中表达了植酸酶，如果实现大规模生产，将集植酸酶和微生态产品两种效果于一身，具有极大的实际意义。饲料作物的植酸酶转基因工程也已取得一定进展，由中国农业科学院生物技术研究所培育的转植酸酶基因玉米经农业部批准，已于2009年8月发放了生产应用安全证书。已在大豆[29]中表达了植酸酶，如果能在更多饲用植物中表达植酸酶并提高其产量和耐温性，将具有巨大的应用和商业价值。此外，随着动物转基因技术的成熟，植酸酶转基因动物研究也已展开。尽管采用多种分子生物学手段来改善植酸酶的耐温、产量、肠道环境抗性等问题，但是一种广适酶的开发仍然是悬而未决的课题，这方面的研究仍将继续开展。

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