分子粪便学在濒危野生动物研究中的应用

李秦豫,艾斯卡尔·买买提,肖白桦,马合木提·哈力克

（新疆大学生命科学与技术学院,新疆乌鲁木齐,830046）

近年来,随着生态环境的不断恶化和对野生动物的乱捕滥杀,许多野生动物的种群数量下降,越来越多的动物到了濒临灭绝的境地,而人们需要更多的了解这些动物,以制定适宜的保护和管理措施.但是由于这些野生动物处于濒危状态,这就意味着传统的取样方法已经不再适用了.为了避免取样对野生动物的伤害,一种新的取样方法——非损伤取样（Noninvasive sampling）应用而生.这种方法可以在不触及或伤害野生动物本身的情况下,通过收集其自然脱落的毛发、粪便、尿液、食物残渣、鳞片和卵壳等不同形式的分析样品而进行遗传分析的一种取样方法[1].在所有的非损伤性取样中,收集粪便样品对动物的干扰最小,且最容易收集,因此利用粪便样品来获取基因组DNA,然后借助PCR技术和多种分子标记,从而对动物进行遗传分析是最具潜在应用价值的.

1 粪便作为DNA研究材料的可行性

野生动物的粪便中的主要成分是一些未消化的食物残渣,这些食物残渣在经过肠道时经常会夹杂有大量脱落的肠道上皮细胞一起排除体外.研究表明,每g人的新鲜粪便中会含有105个肠道细胞[2],且大部分是活细胞.这意味着理论上可以从粪便中获取粪便生产者的DNA进行遗传分析,如RFLP,RAPD和AFLP,SSCP以及微卫星标记等,这对于濒危野生动物的遗传多样性研究有着非常重要的意义.同时粪便中还含有线粒体DNA,而线粒体DNA主要来自受精卵的卵母细胞,因此粪便DNA还是母系遗传的良好材料.虽然粪便DNA不可避免的存在着一定程度的降解,然而随着PCR技术的广泛应用,已经能够从质量不高的DNA模板中扩增出目的片段,这就意味着分子粪便学在方法上已经日趋成熟,并进入了实际的应用阶段.Hoss等人发表了第一篇关于从熊的粪便中获取DNA的文章,标志着粪便DNA分析技术的建立,并开始为动物生态学和保护遗传学提供有价值的材料[3].Reed等人通过抽提海豹粪便DNA来分析海豹的种类、性别、个体还有食性和寄生虫分析,首次提出了分子粪便学（Molecularscatology）的概念[4],即将传统的粪便分析方法与分子生物学相结合的一种全新的取样分析方法.

2 粪便DNA的研究方法

2.1 粪便的采集

粪便样本的采集是整个试验过程的第一步,直接影响着实验结果的好坏.研究人员发现从新鲜样品中提取的DNA要比陈旧样品中提取的DNA扩增效果要好,而且在冬季采集的样品效果要比在夏季采集的更有利于遗传多样性的分析[5].但是由于野生动物在野外的排便是随机的,要获取新鲜的粪便样本有一定的困难,因此在取样之前要进行详细的方案设计.在冬季沿着野生动物的雪地足迹收集样品,将会明显的提高试验数据的准确度.对采集地点事先进行实地考察,了解野生动物的主要活动地域和活动时间,尽可能第一时间采取粪便样本.采样时并不一定要采集整个粪便,对于大型哺乳动物来说,可以仅采集粪便外表的粘膜层就足以供DNA提取,这部分所含细胞较多,杂质少,可以获取纯度较高的DNA.为了避免样品的交叉污染,采集时应带一次性器具,采集到的每一粒都要分别进行分装,避免损伤粪便颗粒表层,以保证目的DNA的质量.做好标记,注明采集地点、时间、坐标、采样时的天气（温度和湿度）及该区域的食物组成.

2.2 粪便的保存

粪便在采集后须尽快保存.在保存粪便的过程中,首先应避免DNA的降解.由于核酸内切酶被认为是降解DNA的主要因素,因此大多数保存方法都是为了降低其核酸内切酶的活性[6]；其次因为采集粪便的地点一般都是在野外,因此粪便的保存方法应该便于野外使用和运输,而且对于不同物种及物种的不同生境,保存的方法也应有所区别.目前粪便的保存方法主要有冷冻法[7-8]、干燥法[9-11]、乙醇保存[12-14]、硅珠保存[15]、福尔马林保存[16]、二甲基砜（DMSO）保存[17].

不同的保存方法对提取DNA的质量有较大的影响,在对狒狒的粪便DNA分析时发现,DETs（DMSO/EDTA/Tris盐溶液）保存法对核基因有明显得保存效果,而干燥保存和乙醇保存对线粒体DNA有较好的效果[18].在国内从不同方法保存的东北马鹿粪便中提取DNA,认为低温冷冻法可靠易行,而乙醇保存和干燥保存的样品中提取的目的DNA质量较低,分析其原因是酒精作为一种抑制剂,在PCR时抑制了反应的进行[19]；干燥法在干燥过程中样品可能被污染或表皮脱落致使PCR质量较差,在澳大利亚两种食草动物和三种食肉动物的粪便研究中发现干燥保存和冷冻保存有着更好的效果[20].这说明了在不同物种和不同生境中,最适保存方法也是有所区别的.

2.3 粪便DNA的提取

粪便DNA是由其生产者少量脱落的上皮细胞抽提而出,而这些细胞是处在一个潮湿而且成分复杂的环境中,不仅含有大量的肠道微生物,而且还有未消化的食物、消化酶、胆碱、胆红素等[21],在食草动物中还含有多糖,这些都会影响粪便DNA的提取和扩增[22].因此,如何有效的去除粪便样品中的各种抑制剂,是试验成功与否的关键.目前国内外从粪便中提取DNA应用的最为广泛的方法主要有以下四种：

2.3.1 试剂盒提取 现在公认的用于粪便DNA提取的试剂盒效果最好的是德国Qiagen生产的试剂盒QIAamp DNA Stool Kit.这种方法操作简单,用时少,而且去除抑制物的效果很好.但是价格比较昂贵,而且因为专利原因,试剂中的成分及含量不是很清楚,如果操作失败,分析原因也是一件比较困难的事情,并且不同动物的食性和采集粪便时的自然环境不同,影响DNA提取因素的差异较大,因此针对不同的动物应该加以适当的改进.

2.3.2 硫氰酸胍（GuSCN）-二氧化硅（SiO2）法 GuSCN是一种很强的蛋白变性剂,可以使细胞裂解,使核酸水解酶失活.当GuSCN浓度较高的时候,二氧化硅颗粒可以特意性吸附DNA,从而可以直接提出高纯度的DNA而避免一些干扰因子,达到纯化DNA的目的.用此方法成功的从海豹粪便中抽提出高质量的DNA,并以此分辨了海豹的种,性别和个体[4].在对欧洲獾的研究中也用此方法从粪便中提取了高质量的模板[13].

2.3.3 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法 CTAB是一种阳离子去污剂,它能与蛋白质和大多数多糖形成复合物,从而使DNA与多糖分开,再用乙醇沉淀DNA可出去CTAB从而得到纯度较高的DNA.因此,利用CTAB来处理一些植食性动物的粪便,可以有效的去除多糖等粪便中主要影响PCR的杂质.在用蛋白酶K裂解粪便的同时加入CTAB,得到的DNA产物可成功进行PCR扩增[7].

2.3.4 预处理－有机溶剂法 在裂解前用丙酮,乙醇或者水预处理粪便,可以将粪便中的色素,多糖及一些有机盐等PCR抑制物除去,在通过常规的有机溶剂抽提方法提取出DNA,其效果明显优于未处理的粪便DNA.将此方法与多管法相结合,在无水乙醇常温保存4.5年的短尾猴粪便中提取DNA获得了成功[23].

3 粪便DNA在濒危野生动物保护中的应用

3.1 物种鉴定

在野生环境中,由于不能近距离的观察野生动物,许多野生动物单从外形上很难区别开.在传统的粪便学中根据粪便的大小、性状、未消化的食物残渣来对物种进行鉴定；在结合分子生物学后,可以根据微卫星等位基因频率的不同来区分不同的物种.利用人的微卫星成功的对四种狒狒进行了鉴定[24].通过粪便提取线粒体DNA,并对其细胞色素区进行PCR扩增,再对PCR产物进行酶切,根据酶切片段的比较,将分布在同一地区的红狐,白狐,郊狼,家犬以及一种濒危的狐狸很好的区分开[25].用线粒体DNA细胞色素b基因特异性引物对雪豹分布区采集的109份粪便样品进行鉴定,发现有31份粪便来自雪豹,其他的分别来自猞猁,赤狐,狼或狗[26].

3.2 个体识别和数量调查

目前在个体识别中用的最多的是微卫星标记,因为在个体中微卫星呈现出高度的多态性,而且符合孟德尔遗传.用微卫星技术对82个海豹粪便样品成功的进行了个体识别[4].利用家猫的微卫星作为引物,对雪豹粪便样品进行了基因型分析,成功的鉴别出了10只不同的雪豹个体[26].对广西九重山一群白头叶猴粪便进行提取DNA并分型,成功的从19个粪便样本中鉴定出14个个体[27].在传统的种群数量调查中,一般是事先设定样线或样方,再通过目击,足迹或粪便等计算动物数量,并以此为基础,估算整个动物分布区的动物数量.但这种方法容易受到动物分布的均匀程度及单个个体重复计算的影响.而利用分子粪便学,我们可以通过反复搜集特定区域的粪便,进行微卫星或指纹图谱分析进行个体识别,从而估计其种群数量.

3.3 性别鉴定

在动物的种群统计中,濒危动物性别的鉴定也是估计该濒危动物生存力的一个重要指标.如果雌雄严重失衡,终将影响该濒危物种的繁殖力,造成严重的近交衰退,继而影响其有效种群的大小,种群发展动态及种群生存力.对于哺乳动物而言,可以通过Y染色体上的特定基因（如SRY基因,ZFY基因）进行扩增,通过扩增的结果比较,从而鉴定出动物的性别.利用粪便中提取的DNA,进行PCR扩增,成功的鉴定出两只太阳熊的性别为一雌一雄[15].利用分子粪便学检测太阳岛地区灰松鼠雌雄比例为59：27[28].

3.4 亲缘关系的鉴定

在濒危动物的保护中,了解种群的亲缘关系也是不可缺少的内容.在意大利北部的Brenta地区有一种棕熊濒临灭绝,为了保护该种群,扩增其粪便中的线粒体DNA,确立了欧洲棕熊各种群之间的亲缘关系,并建议引进同Brenta亲缘关系最近的Slovenia品种来恢复Brenta地区的棕熊种群[29].

3.5 父权的认定

在动物体内,线粒体DNA是母系遗传的,通过线粒体DNA的基因片段,进行序列分析,通过比较子兽和母兽以及可能父亲的微卫星DNA基因型即可进行父权排除的鉴定,这对于更好的管理和保护濒危野生动物,保护它们的遗传多样性有着重要的意义.

3.6 食性及寄生虫分析

由于粪便中含有未消化的食物残渣,而且一些寄生虫及其卵也随着粪便排出,所以结合分子生物学,对食物和寄生生物的特定基因进行扩增和测定,可以使食物和病原体的检测率大大提高,因此粪便还是了解野生动物的食性和寄生虫疾病的优良材料[30].

3.7 构建指纹图谱

通过对大熊猫的粪便DNA提取,并借助限制性酶切,分子杂交,同位素标记等技术成功的构建了大熊猫指纹图谱,为大熊猫的保护管理计划提供了有力的工具[31].

3.8 与GIS技术的结合

美国鱼和野生生物服务中心在对红狼（canis rufus）进行种群恢复的过程中,由于杂合体的存在使这项计划的实施受到限制,主要有2个方面的原因：一是单从形态上很难确定杂合的个体；二是需要找到郊狼(canis larans）和杂合体所生活的区域,但是此区域接近6000 km.为了解决这个问题,通过测定粪便中的线粒体DNA并且应用GIS技术对每个粪便样本进行GPS定位和标注,从而对大范围分布的郊狼和杂合体进行了研究,并确定了杂合体的存在[32].

4 粪便DNA研究局限

粪便作为分子材料在研究过程中首先遇到的问题是消化道脱落细胞量少而且在野外存在的时间一般都比较长,存在着一定的降解问题；而且野外采集的粪便材料还存在着一些外源DNA的污染；粪便中有些物质（如未消化的食物、消化酶、粘液、胆红素等）常常影响Taq酶的活性,从而影响PCR的扩增结果；另外在一些肉食动物的粪便样品中,还存在着其他一些动物的残渣,这在粪便DNA的研究中就会受到很大的干扰,难以获得准确的结果.在进行棕熊的分子粪便学研究中,就发现仅有20%的粪便样品可以提供足够量的DNA用于微卫星位点分析[33].

5 结束语

结合现代分子生物技术兴起的分子粪便学,由于其非损伤性的取样方法,试验材料的易获得,并且粪便样品的采集具有随机性,可以显著的增加研究对象,获得重要的种群遗传参数.这是其他取样方法无法做到的,因此在对于野生濒危动物的保护和管理具有十分重要的意义.随着许多研究人员对分子粪便学的研究深入,对其所遇到的问题也逐渐提出了相应解决方法,我们有理由相信这项新兴的技术会在生命科学的众多领域中焕发光彩.

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