不同功能化量子点与细胞的非特异性作用研究*

王 青,张鹏飞,羊小海,王柯敏,武春雷

(湖南大学 化学生物传感与计量学国家重点实验室,化学化工学院,生物纳米与分子工程湖南省重点实验室,湖南 长沙 410082)

随着纳米技术的飞速发展,纳米颗粒在生物医学检测、生物活性物质或细胞快速分离、药物可控性定向传递和释放等领域显示出巨大的应用前景[1-2],因此纳米颗粒与细胞的相互作用受到人们广泛关注.纳米颗粒与细胞的相互作用是一个复杂的过程,该过程除了与纳米颗粒本身特性相关,包括纳米颗粒形状[3]、大小[4]、带电荷量[5]、表面特性[6],以及发生聚集的能力[7]等;还和细胞所处的周期以及细胞类型密切相关.

半导体荧光量子点(Quantum Dots,QDs)具有独特的光学性质,如:吸收光谱宽且连续,荧光发射光谱窄而对称,光学稳定性强,抗光漂白性能好等[8-9],非常适合用于细胞生命过程的可视化研究.

本文使用激光共聚焦荧光显微镜研究了活细胞对不同功能化基团修饰的量子点的非特异性吸附行为,并考察了量子点浓度、培育时间、培养基中的血清及温度等因素对其的影响,为进一步开展基于量子点的细胞成像研究与应用提供参考.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

硒粉(纯度 99.5%)、氧化镉(纯度 99.998%)、氧化锌(纯度99%)、三辛基膦(纯度90%)、三辛基氧化膦(纯度90%)、油酸(纯度90%)和硫粉(纯度99%)均购自美国Sigma-Aldrich公司;十八胺(纯度97%)和十八烯(纯度90%)购自比利时Acros公司;1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-羧基(聚乙二醇2000)(COOH-PEG-PE)、1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-氨基(聚乙二醇2000)(NH2-PEG-PE)和1,2-二硬脂酰-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-甲基(聚乙二醇2000)(CH3-PEG-PE)购自美国Avanti lipid公司;其它试剂均为国产分析纯,实验用水均为Millipore超纯水(18.2 M Ω·cm).非洲绿猴肾细胞系(COS-7)为本实验室库存,复苏后用常规方法接种于质量比为15%小牛血清的RPMI1640完全培养基(加青霉素100 IU/mL,链霉素100 IU/mL)中,于 37 ℃,体积比为5%CO2的细胞培养箱中培养,实验过程中COS-7细胞分别接种于玻璃底培养皿中.实验中所用缓冲溶液均为10 mM PBS缓冲溶液(pH=7.4).

FV500-IX70激光共聚焦荧光显微镜(日本,Olympus公司);Malvern Zetasizer 3000HS分析仪(英国,Malvern公司);Nu-4750E细胞培养箱(美国,Nuair公司);UV-1601紫外-可见分光光度计(日本,Shimadzu公司);F-4500荧光光谱仪(日本,Hitachi公司);CS150GX超高速离心机(日本,Hitachi公司).

1.2 量子点表面不同功能化基团的修饰与表征

参照文献[10]制备CdSe/ZnS量子点,并对量子点表面进行修饰.分别将 COOH-PEG-PE,NH2-PEG-PE,CH3-PEG-PE的氯仿溶液和CdSe/ZnS量子点混合于圆底烧瓶中,控制真空度为0.1 Pa,温度在37℃,旋转蒸发仪转速为100 r/min,恒温减压旋转蒸发成一层透明薄膜.然后在圆底烧瓶中加入少量的超纯水溶解并将溶液移入超速离心管,使用超高速离心机,在10℃,500 000 g条件下离心2 h,取红色沉淀重新分散在超纯水中即可分别得到氨基表面(NH2-PEG-QDs),羧基表面(COOH-PEG-QDs),甲基表面(CH3-PEGQDs)的磷脂胶束修饰的量子点溶液.按文献[11]的方法对修饰后的量子点进行定量,并分别用紫外-可见分光光度计、荧光光谱仪和Zetasizer分析仪对不同功能基团修饰的量子点进行表征.

1.3 不同功能化基团修饰的量子点在细胞表面的非特异性吸附

将细胞分别与含有不同浓度量子点(终浓度5～800 nM)的新鲜无血清培养基在37℃培育6 h后,用PBS缓冲液洗涤,加入1 mL无血清无酚红培养基,用激光共聚焦显微镜成像,以研究量子点浓度的影响.

将细胞分别与含有终浓度100 nM量子点的新鲜无血清培养基在37℃培育不同时间(0.5～24 h)后,用PBS缓冲液洗涤,加入1 mL无血清无酚红培养基,用激光共聚焦显微镜成像,以研究培育时间的影响.

将细胞分别与含有终浓度100 nM量子点的新鲜无血清培养基和有血清培养基在37℃孵育18 h后,用PBS缓冲液洗涤,加入1 mL无血清无酚红培养基,用激光共聚焦显微镜成像,以研究培养基中的血清的影响.

将细胞分别与含有终浓度100 nM量子点的新鲜无血清培养基在不同温度条件下(4℃,10℃,25℃,37℃)孵育18 h后,用 PBS缓冲液洗涤,加入1 mL无血清无酚红培养基,进行激光共聚焦显微镜成像,以研究培养温度的影响.

2 结果与讨论

2.1 不同功能化基团修饰的量子点表征

不同功能化基团修饰的量子点的ξ电位分别为(46.4±0.8)mV(NH2-PEG-QDs),(-1.2±0.8)mV(CH3-PEG-QDs)和(-36.1±0.8)mV(COOH-PEG-QDs).这种电位差别是由于颗粒表面修饰的化学基团不同所致:NH2-PEG-QDs因其表面的—NH2在水溶液中质子化(—NH+3)而带正电荷,从而表现出较强的正电势;COOH-PEGQDs点表面的—COOH在水溶液中去质子化(—COO—)而带负电荷,因此呈现出较强的负电势;对于CH3-PEG-QDs而言,甲基很难因质子化或者去质子化而带电荷,但由于该量子点表面修饰有磷脂分子,而磷脂分子带有负电荷,使得CH3-PEGQDs带少量负电荷.另外,这三种功能化基团修饰的量子点的荧光发射波长均为580 nm,和未修饰的量子点荧光光谱一致,说明表面修饰没有对量子点的荧光特性造成明显影响见图1.

图1 不同修饰量子点的吸收光谱与荧光光谱Fig.1 Absorbance and fluorescence spectra of QDs with different modification

2.2 不同功能化基团修饰的量子点与细胞的非特异性吸附

2.2.1 量子点浓度的影响

考察了不同浓度的NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分别与COS-7细胞作用6 h的情况,结果如图2所示.其中从左至右量子点浓度分别为5 nM 、20 nM 、50 nM、100 nM 、200 nM、400 nM和800 nM,从上至下分别为NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEGQDs分别与COS-7细胞作用 6 h的情况.对于NH2-PEG-QDs而言,当浓度为50 nM时,细胞上出现明显荧光信号,并且随着量子点浓度的增加而增强,细胞上的荧光强度也逐渐增加;对于COOH-PEG-QDs而言,当浓度达到100 nM时,可观察到细胞上出现荧光信号,其强度也随着量子点浓度增加而增强;而对于CH3-PEG-QDs而言,当浓度高达400 nM 时细胞上才可观察到荧光信号.

这3种量子点表面没有细胞膜特异性的配体,因此图2中细胞上的荧光信号是由量子点与细胞之间非特异性的静电吸附所引起的.大多数细胞膜表面带负电荷,容易吸附表面带正电荷的量子点(如NH2-PEG-QDs);另外,细胞膜表面还镶嵌了各种膜蛋白,有些膜蛋白在生理条件下带正电荷,会吸附表面带负电荷的量子点(如COOH-PEG-QDs);相对而言,表面几乎不带电荷的量子点(如CH3-PEG-QDs)与细胞的非特异性吸附就显得小些.

2.2.2 共孵育时间的影响

考察了NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分别与COS-7细胞在37℃孵育不同时间的情况,结果如图3所示.其中从左至右孵育时间分别为0.5 h、1 h、3 h 、6 h、12 h 、18 h 和24 h,从上至下分别为NH2-PEG-QDs,COOHPEG-QDs及CH3-PEG-QDs与COS-7细胞在37℃孵育不同时间的情况.随着孵育时间的增加,均可观测到细胞上荧光信号强度的增强,说明细胞上非特异性吸附这三种量子点的量在增加.在相同的时间内,NH2-PEG-QDs在COS-7细胞上的吸附最多,其次是COOH-PEG-QDs,CH3-PEGQD的吸附最少.

图2 量子点浓度的影响孵育温度为37℃,时间为6h.标尺:50 mm.物镜:20倍Fig.2 Effect of concentration of QDs on QD-cell interactions

图3 共孵育时间的影响量子点浓度为 100 nM,孵育温度为37℃.标尺:50 mm.物镜:20倍Fig.3 Effect of incubation time on QD-cell interactions

2.2.3 血清的影响

考察了培养基中血清对不同功能化基团修饰的量子点与细胞作用的影响,结果如图4所示.从图中可以看出,血清的存在可以明显降低量子点在细胞上的吸附,这可能是由于血清中的某些成分与量子点发生非特异性吸附,从而改变量子点表面的电荷与大小,进而使得这些量子点难以吸附在细胞上.

图4 血清的影响量子点浓度为100 nM,孵育温度为37℃,孵育时间为18 h;标尺:50 μ m;物镜:20倍Fig.4 Effect of serum on QD-cell interactions

2.2.4 孵育温度的影响

考察了NH2-PEG-QDs,COOH-PEG-QDs及CH3-PEG-QDs分别与COS-7细胞在不同温度下的孵育情况,结果如图5所示.从图可知,孵育温度对NH2-PEG-QDs与细胞作用的影响非常明显:随着孵育温度升高,荧光强度明显增加,说明细胞上量子点的数量明显增加.孵育温度对COOHPEG-QDs与细胞作用的影响相对较小,而对CH3-PEG-QD几乎没有影响.

一般而言,细胞与量子点的作用主要包括量子点在细胞膜表面的吸附和量子点的内化两个阶段.当细胞在4℃培育时,由于缺少能量,细胞的生命活动受到了抑制,此时量子点与细胞作用主要是在细胞膜表面的吸附.在37℃培育时,量子点的吸附和内化同时发生,所以在37℃培育温度下,对NH2-PEG-QDs与COOH-PEG-QDs而言,与细胞结合的量子点的量要远远高于在4℃条件下的结合量.而CH3-PEG-QD,由于表面ξ电位为(-1.2 ±0.8)mV,既不易吸附在细胞表面,也不易通过内化进入细胞,因此孵育温度对其与细胞作用影响不大.

图5 孵育温度的影响量子点浓度为100 nM,孵育时间为18 h;标尺:50 μ m;物镜:20 倍Fig.5 Effect of incubation temperature on QD-cell interactions

综上所述,量子点与细胞的作用是一个依赖于量子点的浓度、表面电荷、培育时间与温度,并受培养基中血清影响的耗能过程.该研究工作为进一步开展基于量子点的细胞成像研究与应用提供参考.

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