药用植物种质资源超低温保存研究

王跃华,林抗雪,刘益丽,马良良,江明殊

(成都大学生物产业学院,四川成都 610106)

0 引 言

我国是药用植物资源极为丰富的国家之一,据调查,目前我国共有中药资源12 807种,其中药用植物11 146种,占87.03%[1].随着经济的发展,人们对药用植物资源的需求量与日俱增,药用植物资源不仅局限于医疗用药,而且还广泛地应用于美容、保健、饮食等其他方面.长期以来,大多数的药用植物资源都靠野生采挖为主.由于许多药用植物资源的过度开采和使用,其产量已逐年萎缩,特别是一些名贵药用植物,如红景天、川贝母和冬虫夏草等,更是面临着灭绝的危险.因此,对药用植物种质资源实施有效地保护已是一项十分紧迫的任务.

1 药用植物种质资源超低温保存技术

1.1 药用植物种质资源超低温保存基本原理

通常将-80℃以下的温度称为超低温.超低温冷冻保存一般以液氮为冷源,使温度维持在-196℃左右.从理论上分析,生物材料在此温度下,其活细胞内的新陈代谢和生长活动几乎完全停止,处于“生机停顿”状态,从而能够有效保持生物材料的遗传稳定性,同时又可保持生物材料的形态发生潜能,这是一种不需要靠继代而可长期保存植物种质的有效方法.

1.1.1 细胞冻害理论.

植物组织结冰分为胞外结冰和胞内结冰两种.胞外结冰是指在温度降低时,细胞间隙和细胞壁附近的水分结成冰,随着细胞间隙的蒸汽压降低,其周围细胞内的水分便向胞间隙方向移动,扩大了冰晶的体积.胞内结冰是指温度迅速下降,除了胞外结冰外,细胞内的水分也冻结.

细胞冻害是指在细胞内外形成的冰晶对细胞造成的伤害.据文献报道,细胞产生胞外结冰后会引起原生质过度脱水,造成冰晶体对细胞的机械损伤以及蛋白质变性等伤害.在冷冻降温过程中,许多植物细胞对低温下细胞外结冰具有一定的耐受力.但是如果植物细胞内的水结冰,冰晶在形成和融化时会对细胞产生直接的机械破坏作用,使得细胞结构的完整性遭到严重的破坏而无法进行正常的生理功能,从而带来致命损伤.

1.1.2 溶液玻璃化理论.

1.2 药用植物种质资源超低温保存基本程序

1.2.1 材料的选择.

研究表明,植物的基因型、抗冻性以及组织和细胞的年龄、选择材料的大小等因素都对超低温保存效果产生较大的影响,其中植物细胞的生长年龄是决定冻存后细胞存活率的最重要因素之一[3].这是因为处于不同生长阶段的植物材料具有不同的生理状态,处于快速生长期的材料冻后存活率较高.目前,常用的超低温保存材料主要有茎尖分生组织、愈伤组织、植物器官3大类.

(1)茎尖分生组织细胞具有分化程度低的特点,在植物保存后的再生过程中,比其他细胞培养物的遗传稳定性好,所以茎尖分生组织是超低温保存的一种理想材料[5].目前,已成功实现茎尖超低温保存的药用植物有高山红景天、地黄、百合等[6-8].刘剑锋等[6]采用包埋—玻璃化法对高山红景天茎尖进行保存,保存后材料最高成活率接近100%,再生植株生长和分化正常.薛建平等[7]采用玻璃化法保存地黄茎尖,其存活率在76.42%以上.陈辉等[8]通过正交设计试验初步建立了切花百合种质玻璃化法超低温保存的技术方案,百合无菌苗茎尖保存后进行恢复培养,存活率可达到50%以上.

(2)愈伤组织是植物组织培养中最为常见的组织培养物,具有生长速度快,可分化成为各种组织和器官的潜力等特点.但由于愈伤组织在长期继代培养过程中会伴随发生染色体的自发畸变,因此对药用植物愈伤组织的保存显得尤为重要.目前,已成功实现愈伤组织超低温保存的药用植物有浙贝母、高山红景天、银杏和红豆杉等[9-13].苏新等[9]研究发现,超低温保存浙贝母愈伤组织中,经慢速冷冻后的愈伤组织存活率可达78.2%,且成功实现增殖及植株再生.刘剑锋等[10]研究表明,采用玻璃化法保存高山红景天愈伤组织后存活率可达到78.24%,解冻后可诱导成苗.徐刚标等[11]对银杏子叶愈伤组织进行了超低温保存研究,采用分步冷冻法进行超低温保存后其细胞相对存活率可达60%以上,恢复培养时细胞能恢复生长.

(3)花粉是重要的植物种质形式之一,具有丰富的遗传多样性,是种质保存以及杂交育种的重要材料[14].花粉的保存方式一般采用超低温保存,其是将花粉进行预处理和适当脱水后直接投入液氮中.目前,已见报道的实现花粉超低温保存的药用植物有人参、浙贝母、杜仲、山茱萸和高山红景天等[14-16].苏新[15]用分步冷冻法保存浙贝母花粉发现,经低温保存后的花粉授粉后能有效结实.刘剑锋等[16]研究发现高山红景天花粉的超低温保存过程中,逐步预冻法与逐步解冻法均能大幅度提升超低温保存后花粉的萌发力.

1.2.2 材料的预处理.

为了使保存材料达到超低温保存所要求的低含水量等生理特性,必须对材料进行预处理,其目的是为了提高处于分裂期细胞的数目,减少细胞内自由水含量,增强细胞抗寒力.目前,材料预处理采用的具体方法有低温锻炼、继代培养和预培养3种.

Connections of summer anomalous precipitation in Guangdong and Guangxi regions with SST anomalies east of

(1)低温锻炼法通常是将需要保存的材料放在0℃左右温度下处理数天至数星期,也可分不同温度组进行变温处理,以提高细胞膜磷脂的不饱和程度而增加抗低温的能力,还可使细胞发生保护性脱水和产生抗冻蛋白[17].

(2)继代培养法是将处于快速生长期的材料进行多次转接继代,此预处理方法可大大增加有丝分裂细胞的数目.研究表明,处于有丝分裂前后的细胞抗冻能力较强,其继代培养后的材料也具有较高的抗冻能力,其冻后存活率也随之提高[18].

(3)预培养法是在培养基中加入冷冻保护剂如山梨醇、二甲基亚砜等,或诱导产生抗寒力的物质如脱落酸、海藻糖等,当培养基中的冷冻保护剂进入细胞组织后可使细胞内外形成渗透压,细胞可缓和的脱去部分水,而脱落酸、海藻糖等物质可诱导细胞分泌抗寒物质.目前,该方法常与低温锻炼结合,已在多种植物中获得成功.

1.2.3 冷冻保护剂选择与冷冻处理方法.

(1)在药用植物种质资源的超低温保存过程中,不管采用何种冷冻方法,冷冻保护剂都是不可缺少的.理想的冷冻保护剂应能在超低温保存过程中保护组织免受冰冻伤害,且适当浓度下对细胞无毒或低毒,解冻后容易从组织中清除.目前广泛使用的冷冻保护剂分为渗透性和非渗透性两种.渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、甘油、乙二醇等,此类保护剂多数为低分子中性物质,在溶液中易结合水分子发生水合作用,使溶液的粘性增加,弱化了水的结晶过程,从而起到了保护效果;非渗透性保护剂包括蔗糖、山梨醇、聚乙二醇等,这类物质能溶于水,但不能进入细胞,它能使细胞间溶液呈过冷状态,阻止胞外结冰从而起到保护作用.孙成龙等[19]研究发现复合保护剂优于单一保护剂,其优越性在于它能充分发挥各种成分的保护作用,从而产生累加效应.所以在冷冻保护的实际过程中,人们常使用由两种或两种以上的保护剂组成的复合保护剂.

目前,复合保护剂为可分为渗透性与渗透性结合型、渗透性与非渗透性结合型和非渗透性与非渗透性结合型3大类型.

(2)冷冻处理是超低温保存过程中非常关键的一个环节,在冷冻处理过程中,随着温度的降低细胞内有形成冰晶的危险,因此其降温速度应该是以不引起胞内冻结或形成冰晶为准.目前所采用的冷冻方法可分为基于快速降温的冷冻法、基于保护性脱水的冷冻法和基于玻璃化理论的冷冻法等.

快速降温的冷冻方法是以快速降温时溶液缺乏形成晶核的时间从而避免细胞内结冰为理论基础.快速降温法的具体步骤是将植物材料从0℃或预处理温度直接投入液氮中,使温度瞬时降到-196℃,在此过程中细胞内的水分子未来得及形成结晶中心从而避免了细胞内结冰的危险.此方法简单,不需复杂、昂贵的设备,但由于快速冷冻法没有采用保护性脱水环节,因此该方法适用于含水量低或可高度脱水的植物材料,如种子、花粉等[9].

基于保护性脱水的冷冻方法,包括慢速冷冻法、分步冷冻法和逐级降温法.慢速冷冻法的步骤为,材料以0.5℃/min～2℃/min的降温速度,使温度从0℃降到-100℃左右,再立即投入液氮中保存;分步冷冻法的步骤为,材料以0.5℃/min～4℃/min的降温速度,降到-40℃左右,停留一段时间再立即投入液氮;逐级冷冻法的步骤为,将植物材料经过冰冻保护剂0℃预处理后,再逐级通过-10℃、-15℃、-23℃、-35℃、-40℃等,每级温度停留10 min左右,然后投入液氮中[20].植物材料在逐步降温的过程中,可使细胞内水分充分脱出,从而有效地避免了植物材料在冷冻保存过程中产生细胞内结冰,以达到良好的保存效果,此3种冷冻方法都适用于液泡化程度较高的植物材料.

玻璃化冷冻方法是根据玻璃化理论建立的一种简单而高效的冷冻方法.该方法在快速降温的同时采用高浓度复合保护剂,通过玻璃化溶液弱化水结晶以及使溶液呈过冷状态从而使组织或细胞在-196℃形成无定形玻璃化状态,而没有冰晶的形成,减少了对细胞的损伤,提高了植物材料的存活率.玻璃化冷冻法主要步骤有装载、保护剂(即玻璃化溶液)处理和冷冻几个环节,其中装载时间和玻璃化溶液处理时间对冻后材料存活率的影响很大,因此玻璃化法保存材料的关键在于装载时间和玻璃化溶液处理时间的掌握[21].

1.2.4 解冻洗涤及冻后材料细胞相对存活率测定.

为了防止冻后植物材料次生结冰,一般采用快速解冻的方法,即将液氮保存后的材料在25℃～40℃的水浴中解冻.同时,冻存后植物材料的洗涤也很重要,洗涤的主要目的是除去高浓度的冷冻保护剂和防止细胞因过度吸水而胀破.

冻后植物材料细胞相对存活率的测定目前广泛采用TTC(2,3,5-三苯基氯化四氮唑)染色法[22]. TTC是标准氧化还原色素,氧化状态无色被还原后变成红色.TTC染色法是通过测定呼吸链脱氢酶活性来表征细胞代谢活力的一种有效方法,其原理是TTC在细胞呼吸过程中替代氧接受 H+(H+/e), TTC被还原为TTF而呈现红色,TTF经有机溶剂萃取后,在一定波长下测吸光值,其吸收值大小能反映细胞膜电子传递链的递氢能力大小.有机物氧化分解生成的氢通过呼吸链与受氢体氧结合而产生能量是细胞能量代谢的关键环节,传递给氧的氢越多,说明脱氢酶活性越高.由于脱氢酶只有活细胞体才能产生,因此,常用脱氢酶活性表达细胞体的活性. TTC染色法通过间接测定脱氢酶的活性,脱氢酶的活性可反映细胞呼吸强度的大小,而细胞呼吸强度可在一定程度上表征细胞活力.

TTC染色是一个酶促反应,所涉及的因素较多如缓冲液的浓度和pH值、TTC的浓度、处理的时间和温度等,而且在TTF的提取过程中往往会有所损失,造成结果不够准确.此外,脱氢酶的活性并不能完全表征细胞的活力,因此,冻后材料细胞相对存活率的测定方法仍有待提高.

1.2.5 冻后材料遗传稳定性的检测.

植物种质资源保存的最根本目的是保持其遗传基因的稳定性,控制遗传性状不发生变化.因此,超低温冻存后材料的遗传特性的检测是十分必要的.目前,冻存后植物材料的遗传特性的检测主要从形态学和细胞学特征观察、同工酶分析以及RAPD和AFLP分析等方面对超低温保存的植物材料的遗传稳定性进行检测.Liu Y等[23]对超低温保存后苹果茎尖的遗传稳定性研究发现其与正常苹果茎尖在形态学、可溶性蛋白和POD酶、DNA水平上均无差异.

2 结 语

超低温保存技术是一项可长期保存药用植物种质资源的有效方法,具有长期性和稳定性的优点,并避免了田间药用植物种质资源保存需要花费巨大的人力、物力、财力的缺点.据统计,采用此技术保存的药用植物材料,可在其后的几十年里根据人们的需要将其取出并用于生产研究,从而有效地保护了濒危野生药用植物的种质资源.

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