树突状细胞与肝脏疾病的研究进展

邢利和,张丽欣,张丽丽

树突状细胞 (dendritic cell,DC)首次由 Steinman和 Cohn于 1973年发现[1],因其细胞形态上具有众多树突状突起而得名。DC是具有强提呈抗原功能的专职抗原提呈细胞 (antigen pressenting cells,APC)。大量研究表明,造成肝脏疾病患者机体免疫功能低下或产生免疫耐受的原因与患者 DC的功能缺陷有关。本文就DC在肝脏疾病中的特点及在治疗方面的研究进展作一综述。

1 DC的特点

1.1 DC的来源和分布 体内 DC均起源于多能干细胞,主要可分为髓系 DC(myebiod,DC1)和淋巴系 DC(lymphoid,DC2)两大类。DC可从骨髓或外周血单核细胞中诱导产生,DC1与单核细胞、粒细胞有共同的祖细胞,DC2与 T细胞和 NK细胞有共同的前体细胞[2]。DC在人体中分布广泛,除了大脑、角膜外几乎全身各组织器官均有分布。根据其不同的发育阶段和特点,DC可分为以下几种:(1)DC祖细胞 (progenitor DC):存在于骨髓和肝脏;(2)DC前体细胞(precuror DC):存在于血液中,如外周血和脐血;(3)未成熟 DC(immature DC):细胞在局部组织分化,主要存在于外周组织;(4)成熟 DC(mature DC):离开外周组织并通过血液和淋巴迁移到淋巴组织[3-4]。因此,DC处于一个动态的发育过程中,每一阶段都有不同的功能、动力学特点。

1.2 DC的分化发育 DC由骨髓进入外周组织时通常以未成熟形态存在。它的发育主要经过三个阶段:未成熟阶段、成熟阶段和凋亡阶段。当抗原或病原体进入机体,局部的 DC可通过细胞表面的受体识别微生物糖原分子、核酸,感知病原体的入侵[5-6]。DC分别通过组织相容性复合体 (MHC)Ⅰ类和Ⅱ类限制性途径递呈内源性和外源性抗原。随着抗原被吞噬,未成熟 DC开始向成熟方向演变,成熟DC从细胞胞体的各个方面伸出约 10μm的突起,并具有活跃的运动能力,吞噬能力降低而游走能力加强,表达出针对淋巴组织产生的趋化因子的受体。此时 DC成熟指标 CD83逐渐呈高表达,同时包括MHCⅠ类、MHCⅡ类分子在内,CD86、CD80、CD40等辅助刺激因子和黏附分子的表达也有增加[7-8],它们高效地将抗原传递给 T细胞,使 T细胞活化。DC和 T淋巴细胞相互作用后进入成熟第三阶段,即发生凋亡,完成发育。

1.3 DC作为专职 APC具有的特点和免疫学功能 (1)成熟 DC可高水平表达MHC分子、协同刺激分子 B7、CD40等,并分泌多种细胞因子和趋化因子,使得其可以直接活化未致敏的 T细胞,激发机体免疫应答;(2)可表达参与抗原摄取和转运的特殊膜受体;(3)能有效摄取和处理抗原,然后迁移至 T细胞区;(4)抗原提呈效率高,少量抗原和少量 DC即可激活 T细胞;(5)参与天然免疫和 T细胞亚群分化:髓系 DC产生细胞因子白介素 -12(IL-12),诱导辅助性 T细胞(Thl)分化,淋巴系来源的 DC以一种不依赖于 IL-4的方式诱导 Th2分化;(6)诱导免疫耐受:淋巴系来源的 DC主要参与中枢和外周的免疫耐受,髓系 DC通过排除自身应答性克隆参与中枢免疫耐受的诱导。外周血 DC也可携带外来抗原进入胸腺,并由胸腺 DC实现对某些外来抗原的体内致耐受作用。因此可以说 DC是机体免疫应答的主要启动者,在免疫应答的诱导中发挥关键的作用[2]。

2 DC与肝病

2.1 DC与慢性病毒性肝炎

2.1.1 DC与 HBV感染的关系 很多研究显示,HBV感染与 DC功能缺陷有关,表现为免疫应答低下或缺失,机体对病毒产生免疫耐受,不能有效地清除病毒。汪晓莺等[9]研究发现,慢性乙型肝炎患者相同数量的前体细胞经诱导分化形成 DC数量明显减少,成熟度不高,细胞表面的MHCII类分子、协同刺激分子均较正常人明显下降;同时,慢性乙型肝炎患者 DC刺激同种异体淋巴增殖能力显著减低,证明慢性乙型肝炎患者 DC功能处于抑制状态。HBV感染的 DC1经洗涤后,清除细胞表面 HBV,体外培养仍可以产生 HBV DNA,电镜下可见病毒颗粒,提示 DC中有 HBV复制,导致病毒逃避免疫攻击和病毒持续感染[10]。然而,郑曲波等[11]研究发现:慢性重型乙型肝炎患者外周血DC免疫功能亢进,免疫刺激能力也较高。另外,有研究认为,并不是 DC的所有免疫功能与 HBV感染有关。范春蕾等[12]报道,DC非病毒特异性免疫与肝炎病毒清除无关,也不是 HBV持续感染的原因。另有研究者认为,DC产生 HBsAg特异性杀伤性 T淋巴细胞 (CTLs)和 Th1型免疫反应,可能在 HBV感染中起重要作用[13]。

2.1.2 DC与 HCV病毒感染的关系 在HCV感染中,大部分学者认为 DC免疫功能缺陷,协同刺激功能下降,导致 T细胞免疫应答反应削弱,使 HCV持续感染。Susanne等[14]从 HCV感染的单核细胞中分离的 DC,发现其呈递功能消失,对成熟刺激没有反应;从 DC细胞表面标志物和抗原呈递能力中可见 DC保持不成熟的状态;DC的协同刺激能力比健康人单核细胞 DC减弱;而经过抗病毒治疗后,清除 HCV的 DC与健康组表现相似,相应DC表型的表达得以上调。关于 DC和HCV如何相互作用,学者研究不完全一致。Dolganiuc等[15]在研究 HCV感染的DC和健康组的 DC中,发现两者表型标志和凋亡相似,而 IL-10 HBV感染组较健康组升高,IL-12减低,说明 HCV感染是通过 IL-10上调和 IL-12下调,来抑制 DC协同刺激的功能。Sarobe等[16]认为 HCV结构蛋白通过抑制肿瘤坏死因子(TNF)-α和 CD40而削弱 DC成熟,且通过影响 CD4+和CD8+T细胞而抑制体内细胞免疫应答。但是,有部分学者的研究并不支持 DC与 HCV感染存在关系。Longman等[17]研究慢性HCV感染者的 DC功能状态时,发现 HCV感染的 DC有典型成熟表型的表达,能够启动宿主 T淋巴细胞反应,也能刺激流感病毒记忆 T细胞。故认为在 HCV发病机制中,DC的作用有待进一步研究。

2.2 DC与肝硬化 Kim等[18]在原发性胆汁性肝硬化 (PBC)的研究中发现,与慢性丙型肝炎 (CHC)和正常人相比,DC表面抗原人类白细胞抗原 -DR(HLA-DR)、CD86、IL-12和 IL-10的产生无差异,但 DC在混合淋巴细胞反应(MLR)中的刺激能力降低,同时 DC刺激产生的一氧化氮 (NO)水平明显增高。NO被认为可通过抑制多种酶的作用而损伤正常组织,因此 NO的产生可打破自身耐受,在 PBC的发病中起重要作用,提示调节 DC的功能和控制 NO的产生,可以改善 PBC的治疗效果。Ciesek等[19]发现在 PBC发展的各个阶段中,在碎屑样坏死区有 DCs的检出,特别是在 PBC的后期,DCs的聚集说明 PBC的自身免疫性组织损伤不仅局限在胆管中,而且弥漫于肝实质中。同时另有 26例 PBC与 11例 CHC和 10例大胆管阻塞的病例相对照研究中发现,PBC中 DC活性的增加可能是导致其免疫异常的原因[20]。

2.3 DC与肝癌 研究发现,在肝癌患者中 DC细胞功能存在缺陷,肝癌患者局部淋巴结内成熟 DC细胞比例明显异常[21]。许多研究利用专职抗原提呈细胞的免疫激活作用对肝癌患者进行免疫治疗。利用DC提呈肿瘤衍生抗原给免疫系统有多种途径:(1)利用未成熟 DC的主动摄取机制,将肿瘤溶解物或纯化蛋白与未成熟DC共同培养,或将未成熟 DC注射到局部治疗后坏死的肿瘤组织内,使肿瘤蛋白多肽与 MHC-Ⅰ和 MHC-Ⅱ分子结合,激活CD8+和CD4+T细胞[22-25]。 (2)利用质粒或病毒载体转染肿瘤抗原的基因工程 DC疫苗使 DC呈递肿瘤抗原。(3)通过聚乙烯乙二醇或电融合技术,制备肿瘤细胞与 DC融合疫苗,此融合细胞疫苗既表达全肿瘤蛋白,也表达必需的免疫活化分子。

2.4 DC与肝移植 肝移植易形成耐受与白细胞微嵌合体的形成有关,即受体内同时存在供体与受体的造血淋巴细胞,包括供体的肝 DC。肝 DC可以调节宿主抗移植物免疫反应[26]。供体肝 DC在大鼠肝移植受体中能自我繁殖,这些供体来源的DC可能诱导供体的特异性耐受。Khanna等[27]将骨髓 DC和肝 DC局部皮下注射到同种异体鼠体内,结果显示两种细胞都能归巢到淋巴结和脾脏的 T细胞依赖区,但肝 DC诱导 Th2细胞扩增,这可能是肝移植易形成耐受的主要原因,而骨髓 DC仅诱导 Th1细胞大量增生。在小鼠肝移植实验中,供体肝 DC可以在受体次级淋巴组织内选择性产生 IL-10,而骨髓来源 DC则产生 INF-γ,不产生 IL-10[28]。在移植前给予供体肝 DC前体可以延长移植物的存活时间。不成熟状态的肝 DC因缺少共刺激分子,激活幼稚型同种异体T细胞能力弱及选择性诱导 Th2反应,故在肝移植耐受中起重要作用。肝 DC还可以通过凋亡配体、受体途径诱导宿主激活的T细胞凋亡来诱导肝移植耐受[29]。

3 DC的临床研究

3.1 DC与肝炎疫苗 由于 DC能激活细胞免疫,利用 DC制备肝炎病毒核心疫苗治疗慢性肝炎病毒感染,已成为当前免疫学科热点之一。有研究发现,DC的功能与注射乙型肝炎疫苗的反应性有关[30]。他们以 HBV-Tg小鼠模型为研究对象,观察完全氟氏乳化的乙型肝炎疫苗免疫治疗的效果。结果发现 DC功能良好的 23只 HBV-Tg小鼠的 HBsAg在疫苗治疗后完全转阴,HBV DNA水平下降;而 DC功能不良的 19只小鼠则完全没有反应;此外,DC功能良好的小鼠 DC均有 MHC-II和 CD86表达上调及 IL-12产生增加,提示 DC的活化程度较 HBV标志物更有助于预测疫苗治疗的疗效。Racanelli等[31]报道,转染 HCV的DC能诱导和抗病毒免疫相互启动,这有助于合理设计疫苗对抗 HCV。焦栓林等[32]在运用自体 DC疫苗治疗慢性乙型肝炎的临床研究中发现,在体外诱导扩增的自身 DC细胞,经 HBsAg致敏后皮下回输,可以有效抑制 HBV的复制,减少血内病毒载量,清除 HBeAg和促进 HBeAg/抗 HBe的血清转换;DC与其他抗病毒药物联合应用,能增强机体应答能力,达到快速消除病毒的效果。李用国等[33]在 DC疫苗注射治疗慢性乙型肝炎时,发现 DC疫苗有可能活化慢性乙型肝炎患者的免疫反应,对其治疗有一定疗效。

3.2 DC与肝癌 许多研究利用专职抗原提呈细胞的免疫激活作用进行免疫治疗。目前报道的 DC回输治疗肝细胞癌(HCC)的临床研究均是利用肿瘤、肿瘤溶解物或多肽与 DC混合制备自体肿瘤特异性 DC疫苗,以激活针对肿瘤抗原的免疫反应。Ladhams等[22]最早报道的一项研究中,使用未成熟 DC体外与自体肿瘤抗原及粒 -巨噬细胞集落刺激因子、IL-4共同培养后皮内注射治疗 2例 HCC患者,1例减缓了肿瘤生长。未成熟细胞的主要功能是摄取抗原,随后逐步成熟,吞噬活动减弱,活化 T细胞的表面分子上调,并归巢至淋巴结,活化T细胞的细胞因子如IL-12 p70分泌增多。但未成熟 DC注射后在体内成熟程度尚不清楚。Lee等[24]报道 31例进展期 HCC患者进行自体肿瘤溶解物致敏的 DC疫苗经静脉注射治疗,14例患者接受每周 1次共5次冲击治疗,17例患者在冲击治疗后还接受每月 1次的进一步治疗,结果显示该疗法安全,4例患者部分反应,17例疾病稳定,推进治疗的患者 1年生存率明显提高,治疗患者 1年生存率较历史对照差异有统计学意义,显示出较好临床效果。郭运芬等[34]研究发现肝癌患者外周血单核细胞来源的 DC细胞可以具有成熟的细胞形态和表型,适用于 DC的免疫治疗。

3.3 DC与肝移植 有研究显示,处于HBV临床清除状态的肝移植受体术后外周血单个核细胞 (PBMC)来源 DC仍存在增殖、成熟度、细胞表型和形态等异常,导致提呈 HBsAg的能力低下[35]。而影响 DC提呈 HBsAg能力的因素有术前HBV复制状态、术后时间、术后 PBMC HBV DNA载量及术后预防 HBV再感染的方案。同时还观察到,肝移植受体术后PBMC来源 DC经甘露糖受体介导的抗原捕获能力正常。这可能是因为受体途径是DC捕获抗原的特异性途径,受抗原水平影响较小。而 DC对 HBsAg的捕获是通过液相巨胞饮途径进行,此种途径要求很高的抗原水平,因此在水平较低或 DC缺陷时,巨胞饮途径对可溶性抗原内吞不足使其不能被有效提呈给 MHC分子[36]。而目前有可能在肝移植术后,利用抗病毒治疗、免疫佐剂、转基因技术等方法来进一步降低 HBV负载量,增加 DC对 HBsAg的捕获,上调 DC共刺激分子的表达,增强 DC刺激 T、B淋巴细胞的能力,达到重建肝移植受体针对 HBV的主动免疫目的。Bienzle等[37]报道,以 3-脱乙酰单磷酸脂 A(MPL)和 Quillaja saponaira(QS21)为佐剂,与乙肝疫苗制成乳剂以增加抗原提呈细胞对疫苗的捕获,使对肝移植受体的乙肝疫苗接种成功率提高。

纵观近年来的研究发现,DC与慢性肝脏疾病的发生、发展关系密切。DC作为强提呈抗原功能的专职抗原提呈细胞在抗感染免疫中发挥重要作用,相信随着DC分子免疫机制的进一步阐明,DC必将成为治疗慢性肝病的一种有效方法。

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