组织工程化气管的研究进展

罗旭松 周广东 曹谊林

组织工程化气管的研究进展

罗旭松 周广东 曹谊林

先天畸形、外伤和肿瘤等引起的气管缺损临床常见，长段气管狭窄患者的死亡率可高达77%，长段气管闭锁的死亡率基本为100%。气管缺损较短时（＜6 cm），首先考虑断端拉拢吻合，而当缺损长度超过总长度的一半时（＞6 cm），则无法直接吻合，需要进行气管重建。气管处于一个复杂的环境，对外开放，有菌，邻近有重要的血管、神经结构，承担着多项重要的生理功能，并要承受正压和负压的周期波动。这些都对气管重建提出了严格的要求，要求其有足够的强度和弹性以保持管腔通畅，气密性好，同时修复手术应简便、安全。

但是，目前临床和实验研究中常用的3种重建方法都不能完全符合上述要求。①自体组织移植：曾尝试过以筋膜、骨膜、心包、肌皮瓣、软骨片甚至食管、空肠等进行气管重建，不仅会牺牲部分正常组织，而且移植物与正常气管的组织结构和力学特性相差较大，往往最终被吸收，为瘢痕组织所替代[1－3]；②异体气管移植：该方法使患者术后需终身使用抗免疫药物，且供体来源有限，并存在着传染疾患的可能[4]；③人工材料的应用：常见的有金属和高分子假体，植入后容易出现感染和排斥，甚至可能侵蚀邻近血管而引起大出血[5]。这些缺点使得气管缺损的修复一直是困扰临床的难题[6]。

组织工程技术的兴起和快速发展，为气管缺损修复提供了新的思路，有望成为最理想的治疗方法。1994年，Vacanti等[7]首先报道了对组织工程化气管的研究，以牛的软骨细胞与聚乙醇酸（P olyglycolic acid，PGA）在裸小鼠皮下构建出具有一定强度的管状透明软骨，用于修复裸大鼠的气管缺损，术后的裸大鼠可以自主呼吸，最长存活1周。但迄今为止，组织工程化气管研究仍以构建研究为主，有部分研究尝试了实际修复气管缺损，但仅在对范围较小的局部缺损进行片状修补[8－10]，主要是增加气管横截面，解决了气管狭窄的问题。而对于范围较大的节段性缺损进行修补重建，则一直没能取得很大进展，实验动物术后存活均不超过1个月[7,11－12]。2008年，巴塞罗那大学进行了世界首例组织工程化气管临床移植[13]，为以组织工程技术解决气管缺损带来了希望，但是，这项研究还有很多问题尚未解决。

1 种子细胞

气管由“C”形的透明软骨和纤维肌膜组成，从内向外依次为黏膜层、黏膜下层和软骨纤维层，其中最重要的两类组织为软骨和呼吸上皮，组织工程化气管的构建主要针对这两种组织进行。种子细胞即为具备形成软骨功能的软骨种子细胞和能形成呼吸上皮的上皮种子细胞。种子细胞的来源一般有两类：一类是采用分化细胞，如成体软骨细胞和成体气道上皮细胞，优点是分化明确，构建效果好，缺点是已分化细胞在体外随着扩增代数的增加易老化和去分化；另一类种子细胞是干细胞，包括成体干细胞和胚胎干细胞，由于干细胞从理论上具有自我更新、高度增殖、有多向分化能力和免疫原性弱等诸多优点，近年来成为研究热点。目前的研究中，干细胞的分离纯化不易，诱导分化过程比较复杂，且最终的构建效果不够理想。

1.1 软骨种子细胞

1.1.1 软骨细胞

可以从软骨组织中取材，用Ⅱ型胶原酶消化分离出软骨细胞，再将细胞置于含有胎牛血清的F-12或DMEM等培养液中培养扩增，一般采用2～3代以内的软骨细胞进行构建。

Kojima等[11]采用羊鼻中隔的软骨细胞和PGA复合物植入裸大鼠和羊的颈部，8周后均形成气管样组织，用于修复羊颈部5 cm长的气管节段缺损，术后羊存活了2～7 d。本实验室将兔耳廓软骨细胞和管状PGA材料复合物，植于裸鼠皮下6周，形成大体外观、组织学结构均与兔气管软骨相似的管状软骨，用于修复兔气管节段缺损，实验动物术后可自主呼吸，平均存活12.3 d，最长存活28 d[12]。有研究发现，转移生长因子β1（TGF-β1）[14]和胰岛素样生长因子（IGF）[15]对于以软骨细胞构建透明软骨具有积极作用。

上述研究都是采用自体软骨细胞为种子细胞，由于软骨组织的免疫原性较弱，也有研究尝试采用异体软骨细胞进行构建研究。Fuchs等[9]用胎牛的耳软骨和气管软骨的软骨细胞，在体外构建异体组织工程化软骨片，植入胎牛的气管行气管扩大术，胎牛出生后可以自主呼吸，检测发现组织工程化软骨片最终形成了正常的透明软骨，与周围组织整合良好，并上皮化，没有发现明显的免疫排斥现象。

1.1.2 具软骨分化潜能的干细胞

1.1.2.1 成体干细胞

最典型的就是骨髓来源的间充质干细胞（Bone Marrow Stromal Cells，BMSC）。BMSC在一定的环境和因子的作用下，可以向软骨细胞、骨细胞、肌细胞和脂肪细胞等定向分化[16]。Fuchs等[10]将牛的BMSC接种于可降解材料后，用含TGF-β1的培养液培养3个月，另外取牛胚胎软骨细胞接种于同一种材料，两种复合物均植入修复胎牛气管，于植入前和胎牛出生时进行分析。结果显示，所有BMSC材料复合物均表现软骨分化，植入前两组的Ⅱ型胶原与葡萄糖胺聚糖（G lycosaminoglycan，GAG）水平与正常牛胚胎软骨类似；BMSC组的GAG水平更高，而Ⅱ型胶原水平两组无明显差异；但是植入体内后，两组之间无明显差异。Kojima等[17]将羊的BMSC接种于PGA支架上，先在体外加入TGF－β2和IGF培养1周，细胞－支架复合物覆盖一层可缓释TGF－β2的明胶微球后，置入裸鼠皮下6周，可形成软骨组织，其中GAG和羟脯氨酸含量类似正常软骨。本实验室在体外以BMSC为种子细胞，成功构建出软骨，证实该软骨在植入体内长时间仍能保持软骨的组织学特性[18]。

近年来，有学者相继采用牛的羊水间充质细胞[19]、牛的脐带血间充质前体细胞[20]和人的脂肪源间充质细胞[21]成功构建出组织工程化软骨，一般认为这些细胞类似BMSC，也属成体干细胞，甚至认为它们可能就是来源于BMSC。对这些细胞的研究大大拓展了组织工程化气管构建的种子细胞来源。

1.1.2.2 胚胎干细胞

胚胎干细胞具有无限增殖和全能分化的特性，可能是一种良好的种子细胞。软骨的形态发生要经过一系列过程，这其中重要的诱导信号有骨形态发生蛋白（BMPs）、软骨源性形态发生蛋白（CDMPs）、转化生长因子-β（TGF-β）、胰岛素样生长因子（IGFs）等[22]。研究发现，胚胎干细胞在体外培养的要求极高，很容易分化，而定向分化和纯化的难度较大。Hegert等[23]发现，从小鼠胚胎干细胞来源的软骨细胞在体外培养时可以转分化为成骨和成脂肪细胞等其他间质细胞类型。

1.2 呼吸上皮种子细胞

覆盖鼻腔、气管和支气管的呼吸上皮是假复层纤毛柱状上皮，主要细胞成分是纤毛细胞、杯状细胞和基细胞，这些细胞的基底端均附于基膜上。气管修复手术后，气道上皮及时覆盖替代物，可以促进分泌物排出，抑制吻合口肉芽增生，防止管腔狭窄和堵塞。气管的主要组织相容性复合物Ⅱ（MHC-Ⅱ）抗原就位于黏膜上皮细胞和黏膜下层中的腺体细胞中，在气管软骨细胞和平滑肌细胞中并无表达。因此，构建组织工程化呼吸上皮，主要采用自体上皮细胞为种子细胞。构建物上皮化有两种方法：一种是气管缺损修复后，邻近的正常气道上皮细胞爬行覆盖，可以在组织工程化气管内腔面以生长因子、黏附蛋白等修饰以促进细胞爬行；另一种方式是在构建软骨的同时构建上皮，形成复合组织再进行修复[24－26]。

1.2.1 气道上皮细胞

气道上皮细胞可以通过组织块培养法和消化法得到，后者一般用Dispase过夜冷消化，再用胰酶快速消化得到。气道上皮的培养比软骨细胞复杂和困难，在常规的培养皿里上皮细胞贴壁较难，需预先铺层，常用胶原、G elatin和F ibronectin进行铺层，也可采用3T3细胞等。由于血清影响上皮细胞增殖，上皮细胞的培养一般采用无血清特殊培养基，需添加上皮生长因子等。气道上皮细胞在体外培养传代的过程中很容易出现去分化，使纤毛消失，向成纤维样细胞转变，维持原有表型困难，故一般采用气－液界面培养。Le Visage等[27]以Transwell为人间充质干细胞（M esenchymal stem cells，MSCs）和人支气管上皮细胞（N ormal human bronchial epithelial cells，NHBE）的共培养体系，MSCs在皿底培养，NHBE在液气界面进行培养。对黏液分泌量的测定发现，共培养的NHBE在第18～25天之间分泌量保持恒定，而对照组则在第21天时分泌量达到峰值，说明间充质细胞与上皮细胞的相互作用对维持上皮细胞的分化是有帮助的。

Sakata等[24]先在裸鼠体内形成组织工程化管状软骨，将其中支撑用的模具抽出后，以另外培养的新生羊气管上皮细胞制成的细胞悬液注入管腔，两端闭合后继续培养，3周后腔面形成假复层柱状上皮，部分细胞可观察到纤毛结构，并形成黏膜下组织和丰富的小血管。Walles等[28]将肋软骨细胞、平滑肌细胞、呼吸道上皮细胞和内皮祖细胞一同种植在生物支架上，经检测证实，平滑肌细胞和有纤毛的呼吸道上皮细胞种植成活且具有功能。

1.2.2 气道上皮干细胞

Borthwick等[29]发现，在小鼠气管粘膜下的腺管中，有一种独特的细胞类群表达高水平的角蛋白，气道损伤后用溴脱氧尿苷（BrdU）标记，发现这群细胞可以维持标记存在，被认为是气道上皮干细胞。Coraux等[30]发现，在Ⅰ型胶原诱导下，胚胎干细胞能够分化成为无纤毛的气道分泌细胞（Clara细胞），而在气－液界面培养的条件下，胚胎干细胞可以形成分化完全的气道上皮，含有纤毛细胞、基底细胞、中间上皮细胞和Clara细胞，类似于正常的气管支气管上皮。

2 支架材料

气管组织工程支架常用的有合成类的PGA、PLA、PLGA等，及天然类的胶原、糖氨聚糖、壳聚糖、脱细胞基质等。

合成材料的优点是可以控制材料的很多性状，如显微结构、孔隙率、降解时间和强度等，可塑性强，便于规模生产。PGA是最简单的线性脂肪族聚酯，是高度结晶聚合物，抗张强度好，降解半衰期为2周；PGA在体内先水解为羟基乙酸，再转换为乙醇酸交酯，进入三羧酸循环，最终从肾脏排出。为增加PGA材料的硬度和降解时间，可以在PGA中加PLA，或应用PLGA。PLA的特点是易加工处理且生物力学性能好，降解速率较慢，可以延长支架材料的存在时间，以使种子细胞能够产生足够的细胞外基质。这两种材料的缺点是容易造成局部组织酸性降解产物堆积，在体内会引发炎症反症[31－32]。由于在构建组织工程化气管的起始阶段，细胞－材料复合物力学性能较弱，为支持材料三维空间结构和引导构建的气管组织形状，往往需要采用支撑模具[33]，一般是采用硅胶和高分子材料，待其自身支撑力度足够后再撤除模具。

天然材料更接近细胞在体内的生存环境，其中细胞外基质经过处理可以去除其中的抗原成分，而保留其有效成分和整体结构的完整性。因此，天然材料是软骨组织工程材料的一种良好选择[13]。黄桂林等[34]用改良的去污剂－酶联合多步法脱除家兔、SD大鼠的气管组织中的细胞，然后将脱细胞气管植入SD大鼠面颊部，发现植入12周后与周围组织相容较好，未见明显管腔塌陷及炎性反应。

3 构建方法

3.1 体外构建

从组织工程产品未来的临床应用和产业化角度，应能直接在体外构建组织，但目前单纯体外构建出的软骨存在基质形成较差、强度不够等问题，不能够直接用于修复缺损。其原因可能是，传统的复合物置于培养管或培养瓶中的静态培养无法模拟正常软骨在体内的应力环境，而且静态培养不能及时更新营养物质和排出代谢产物，也很难模拟体内多种生长因子、多种因素综合作用这样一个复杂环境。为了克服这些问题，有学者希望通过生物反应器产生应力，动态地提供营养，尽可能地模拟体内环境；同时某些生物反应器还可以动态地将种子细胞种植在材料上，提高了种植效率和效果[35]。

另有一些研究表明，一定时间的体外培养会对随后的体内培养构建有帮助。Farhadi等[36]将人鼻中隔软骨细胞接种在酯化透明质酸材料后，先在体外培养2周，再植入祼鼠皮下，2周后形成软骨，与直接植入祼鼠形成的软骨相比，Ⅱ型胶原和GAG含量均增高，缝合强度增加2倍左右，抗弯强度和抗拉强度均显著改善，与正常软骨接近。B all等[37]将雄性新西兰大白兔的软骨膜细胞接种在PLA支架上，经体外预培养7 d后，植入雌性兔膝关节修复骨、软骨缺损，通过对Y染色体短臂上的SRY基因进行标记和半定量PCR推算留存供体细胞，证实植入后预培养组和直接植入组的供体细胞都大幅度下降，但预培养组存留的供体细胞明显多于直接植入组。上述实验结果的具体机制还不清楚，可能是经过体外预培养，形成了一定量的初步组织包裹种子细胞和材料纤维，使之不直接暴露于体内组织环境，对种子细胞的干扰不大，减轻了材料直接植入引起的炎症反应[38]，从而提高了目标组织的形成质量，使构建和修复结果的可重复性好。

3.2 体内构建和血管化

体内构建与修复的关系一般有两种：一种是直接在修复部位构建，构建成功时同时也达到修复目的；另一种是异位构建，即先在其他正常位置构建后再移位到病损部位进行修复。这两种构建都会面临的一个重要问题就是新组织在修复部位的再血管化，尤其当缺损范围较大，或修复区域存在严重瘢痕，血循环差，存在感染的种种不利情况，此时通过适当的体内构建方式以快速形成良好的血供对于组织工程化组织的成功构建具有关键的作用[39]。

研究表明，在修复部位采取促进血管生成的因子,如bFGF[40]和VEGF[41]等，或者修复后用富含血供的组织如肌瓣、网膜等将移植物和修复部位覆盖包裹，也会促进移植物的成活。Teramachi等[42]在采用大网膜包裹人工气管假体吻合口的研究中发现，快速而多量的血管生长进入新生黏膜是实现黏膜生长、上皮覆盖的关键。Atala等[43]将扩增的尿道上皮和肌肉细胞种植于膀胱形状的胶原或胶原-PGA复合材料上，体外构建后行自体内植入，以此方法对7个患有脊髓脊膜突出症的患者进行膀胱成形术，术中部分病人构建膀胱上覆盖大网膜，对照组不覆盖。术后平均46个月的随访表明，网膜覆盖组重建后的膀胱体积和顺应性都明显好于不覆盖组。

很多研究采用在富含血供的组织内进行组织构建，然后携带血供对缺损部位进行修复，使构建组织血管化更有保障，无需重建血运[44-45]。Kneser等[46]详细讨论了轴形血管化组织工程骨修复较大骨缺损的方法[46-48]。

组织工程化组织在机体内血管化的具体机制尚不明确，可能与植入后引发的炎症反应有关[49-50]。在炎症和酸性环境中，巨噬细胞和内皮细胞释放各种生长因子（主要是FGF与VEGF），刺激新生毛细血管向构建组织内生长，供给氧分和营养物质。也有研究认为，支架材料与血管化的程度有关，PLGA在局部组织内可引发明显的血管新生反应，形成较密集的毛细血管，而胶原-壳聚糖-羟基磷灰石水凝胶复合材料诱导血管新生的能力很弱[51]。

4 展望

组织工程研究将生物技术与生物医学紧密地结合，有望成为修复重建外科的核心技术和最重要的手段。组织工程化气管的研究几乎涵盖了该领域的各种热点问题，目前尚处于实验和探索阶段，其研究将随着相关的种子细胞研究和新材料的开发而不断进步。

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Q813.1+3

A

1673－0364（2010）03－0167－04

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.03.014

2010年2月1日；

2010年3月20日)

200011上海市上海交通大学医学院附属第九人民医院整复外科；上海市组织工程研究重点实验室。