棉籽饼中棉酚降解菌株的分离及脱毒效果初探

李 佳，袁洪水，朱宝成

河北农业大学生命科学学院，河北 保定 071001

我国是一个产棉大国，而棉籽饼中粗蛋白含量达到34%～38%，高出大米和小麦5～8倍[1，2]，可作为一种理想的蛋白质饲料，一定程度上弥补我国蛋白饲料资源的不足。但是，棉籽饼中含有游离棉酚，直接利用可引起动物棉酚中毒，给养殖户造成巨大的损失[3]。因此，对棉籽饼进行脱毒处理，从而更高效、更安全的利用棉副产品对于畜牧养殖业来说意义重大。

本文是从棉田土壤中筛选能够降解棉籽饼中棉酚的高效菌株，并对其实际应用效果进行了初步验证，希望为棉籽饼这一丰富的粗饲料资源能更好的应用于畜牧业生产贡献一份力量。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 棉籽饼来源

所用棉籽饼原料是河北保定河间某榨油厂的普通压榨油饼，在实验室经过粉碎等工序，使其成为细度为筛孔直径小于0.25 mm的棉籽饼粉。

1.1.2 培养基

棉酚培养基平板：将棉酚5 g加50mlPDA培养基加入50ml蒸馏水，制成平板。

棉酚培养液：棉酚5 g加入100mlPDA培养液。

固态发酵培养基：由棉籽饼和玉米粉等成分组成。

生理生化鉴定培养基，PDA培养基见《真菌鉴定手册》[4]。

1.2 方法

1.2.1 游离棉酚标准曲线测定

制备棉酚标准溶液，采用间苯三酚法[5]测定各样品溶液的吸光度。根据样品溶液棉酚含量（μg）和测定的吸光度值绘制标准曲线并进行回归计算。

1.2.2 棉酚降解菌株的初筛

采用常规涂布法，将土样稀释液涂布棉酚培养基平板，37℃培养。挑取生长较快的菌落并纯化。

1.2.3 棉酚降解菌株的复筛

将初筛得到的菌株接种于棉酚培养液中，37℃，180r/min摇床培养48 h。培养液用0.2 μm微孔滤膜过滤。取过滤除菌的发酵液以间苯三酚法[5]测定其棉酚降解效果。筛选降解效果出现较早且降解活性较高的菌株。

1.2.4 供试菌株的形态鉴定

将活化后的供试菌株划线接种于PDA培养基平板上，37℃培养24 h，观察菌落形态。插片培养供试菌株，在光学显微镜下观察其菌体形态。

1.2.5 供试菌株的生理生化鉴定

选取了V.P试验、淀粉水解等生理生化试验，具体方法见《真菌鉴定手册》[4]。

1.2.6 供试菌株对棉籽饼中棉酚实际降解能力的初步考察

将活化后的菌株接种含有棉籽饼粉的固态发酵培养基，37℃静置培养72 h后，以间苯三酚法测定发酵前后发酵培养基提取液中棉酚的含量并记录。

2 结果与分析

2.1 游离棉酚标准曲线测定

根据棉酚含量与吸光度值进行回归计算，得回归方程：y=64.867x+3.5527（R2=0.9964）。

2.2 棉酚降解菌株的筛选

初筛得到菌株16株，经复筛得到1株降解活性较高的菌株，对棉酚的降解率均超过75%。

2.3 菌种的初步鉴定

2.3.1 形态观察

菌株M12菌落初期呈白色，绒毛状，后期菌落黄色，产黄色孢子，菌丝细长，基内菌丝呈白色绒毛状，不透明，孢子梗端有孢子囊，布满孢子，孢子圆形，呈黄色，菌丝有隔。

2.3.2 生理生化鉴定结果

对菌株进行生理生化试验鉴定，结果表明：V-P测定、过氧化氢酶试验、糖醇发酵试验、产氨试验、甲基红、明胶液化、硝酸盐还原和淀粉水解试验呈阳性；硫化氢试验、苯丙氨酸脱氨酶试验、柠檬酸盐利用和吲哚反应呈阴性。参照《真菌鉴定手册》[4]初步确定菌株M12属于鲁氏毛霉（Mucor rourianus）。

2.4 棉籽饼实际脱毒效果的研究

通过供试菌株对棉籽饼的发酵，发现菌株M12脱毒率达80.1%，棉酚残余量均不足80 mg/kg，达到我国国家标准饲料卫生标准的相关规定（GB13078-2001）：饲料原料棉籽饼中游离棉酚含量≤1200 mg/kg，具有进一步开发的潜力。

3 讨论

目前，常用的棉籽饼脱毒方法有：物理法、化学法及生物发酵脱毒。其中物理法和化学法处理后，棉籽饼产品的营养成分会遭到破坏或流失，同时适口性和采食量也受到了影响[6]。采用微生物发酵棉籽后，其蛋白质和氨基酸显著提高，适口性增加，同时活细胞数也大幅度提高，是非常优良的微生物饲料添加剂[7-8]。因此，采用微生物对棉籽饼脱毒是一种低成本、高效率[8]、工艺设备简单的脱毒方法，具有很好的发展潜力。

[1]石秀侠，程茂基，蔡克周，等.棉籽饼有毒物质及其脱毒方法研究进展[J].饲料博览，2005，6：8-10.

[2]邢志刚，周安国，任花池，等.精氨酸与赖氨酸适宜比例研究进展[J].中国饲料，2004，15：11-13.

[3]赵顺红，张文举.棉籽饼粕生物脱毒的研究进展[J].饲料视角，2007，1：54-55.

[4]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海科学技术出版社，1979.

[5]敖维平，曲明悦.饲料中游离棉酚快速测定适宜条件的筛选[J].中国饲料，2007，20：24-27.

[6]何涛，滕达，张海军，等.微生物降解棉酚的响应面分析优化[J].生产与科研经验，2008，4（34）：71-74.

[7]张庆华，赵新海，钟丽娟，等.三菌株协同固态发酵对棉粕脱毒效果及其生物活性的影响[J].饲料工业，2007，18（28）：37-38.

[8]Nagalakshm I D, Sastry V R B, Pawde A.RumenFementation Pattems and Nutrient Digestion in LambsFed Cottonseed Meal Supplemental Diets[J].AnimalFeed Science and Technology, 2003, 103: 1-4.