新鲜鹿粪便中捕食线虫真菌的分离和鉴定

杨 琳，杨晓燕，李云霞，苏鸿雁

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

新鲜鹿粪便中捕食线虫真菌的分离和鉴定

杨 琳，杨晓燕，李云霞，苏鸿雁*

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

从100份新鲜鹿粪样中分离到4种捕食线虫真菌，通过对其孢子着生方式、孢子形状、捕食器官等形态学观察，鉴定为节丛孢属（Arthrobotrys）的少孢节丛孢（A.oligospora）和弯孢节丛孢（A.musiformis），单顶孢属（Monacrosporium）的椭圆单顶孢（M.ellipososporum）和白色单顶孢（M.candidum）。

捕食线虫真菌；分离；鉴定；鹿粪

家畜寄生线虫可对畜牧业造成严重的损失，对病原线虫的生物防治一直被认为是安全、有效的措施之一。家畜寄生线虫种类繁多，据不完全统计，在青海危害反刍家畜的线虫种类达85种，其中肺线虫13种，消化道线虫71种，横纹肌寄生线虫1种，经济损失十分严重〔1〕。单是侵染青海省牦牛的寄生线虫就有乳突类圆线虫（Strongyloides papillosus）、陕西夏柏特线虫（Chabertia Shanxiensis）、和田古柏线虫（Cooperia hetianensis）、羊夏伯特线虫（Chabertia ovina）、捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）、粗纹食道口线虫（Oesophagostomum.asperum）等40余种〔1〕。

多年来，对家畜线虫病的防治主要以化学药物防治和合理的放牧管理为主。化学药物进行防治副作用较大，寄生线虫对化学驱虫剂抗药性的日益显现，已经成为防治中需要解决的关键问题〔2〕；药物残留以及药物代谢产物对生态环境有严重的负面影响，而且多数化学药物仅对成虫起作用，对虫卵及幼虫无能为力。目前，在研发新型化学驱虫剂的同时，寻找其它替代防治方法日益受到重视，其中，生物防治（简称生防）被认为是最有效和环保的措施之一。

在自然界中广泛分布有一类被称为捕食线虫真菌（nematode-trapping fungi）的线虫天敌，其可以通过菌丝特化形成各种捕食结构（捕食器，traping device）捕食线虫，是目前研发寄生线虫生防制剂的重要资源〔3〕。利用捕食线虫真菌对线虫感染进行控制是一种高新生物防治技术，利用线虫天敌进行生物防治具有无污染、无残留、不易产生抗药性等优点。其特点是对线虫的幼虫起作用，在其感染动物之前就将其杀死，避免了家畜的感染或重复感染〔4〕。在一些畜牧业发达的国家如新西兰，澳大利亚等，利用食线虫真菌防治动物寄生线虫病取得了一定进展〔5-7〕。其中，捕食线虫真菌（Athrobotrys flagrans）已被开发成生防制剂，在新西兰〔8〕、瑞典〔9〕、美国〔10〕等国家成功用于防治家畜寄生线虫。该菌能产生大量厚垣孢子，经动物肠道消化后能成活并捕食粪便中的线虫。给牧羊、牛服用食线虫真菌一段时间后，牧场土壤中感染性幼虫数量显著降低，从而使放牧家畜的胃肠道寄生虫数量和粪便中虫卵数减少，脏器病变减轻，增重获得较大改善，达到了生物防治线虫的目的〔11〕。这些研究和实际应用的现状给我们展示了利用捕食线虫真菌防治家畜寄生线虫的巨大潜力。

在家畜寄生线虫生物防治中，生防菌株既要有较强的浸染力，还需具有较强的抗肠道消化能力。粪便中的捕食线虫真菌以粪便为营养基质在牧场中生存繁衍，很多种类伴随动物的取食而进入肠道，又随粪便排出。因此，从家畜自然粪便中分离的捕食线虫真菌常常具有很强的抗消化特性〔12〕。对特定牧区寄生线虫的生物防治，土著生防菌因长期适合本地区自然环境条件而成为首选的评估资源〔4〕，对青藏高原等特殊生境牧区选育适合本地区的生防菌株尤为重要。

生防资源是生物防治的基础，掌握家畜鲜粪便中捕食线虫真菌的生态分布规律，鉴定和保存大量的菌株资源，研究生防真菌对线虫的侵染机理，评估捕食线虫真菌捕食能力及抗消化能力对于生防制剂的开发和应用非常关键。因此，调查这类生物资源在动物粪便中的分布情况，是生物防治家畜寄生性线虫病的基础和前提条件〔6，13－14〕。本研究主要是对鹿粪中的捕食线虫真菌进行调查，研究结果将极大地丰富动物寄生虫生防资源，为家畜寄生虫防治提供理论基础和物质材料。

1 材料与方法

1.1 鹿粪样 共100份，采自大理州永平县鹿养殖场。样品采集方法：采样时为避免污染，最好是在粪便落地前收集（但如果是已落地的粪便，必须除去表层）。用采样勺采集40g左右的粪便样品装入无菌的塑料封口袋。在自然条件下，2周内处理完所采回的粪便样品。否则，应放入4℃冰箱内。

1.2 诱饵线虫 诱饵线虫的培养：向燕麦片培养基（燕麦片50g装入250mL三角瓶中，加入60%的水，静置30min，使燕麦片充分湿润，121℃灭菌20～30min）接种线虫（Panagrellus redivivus），28℃培养1周左右，观察到三角瓶瓶壁上有线虫爬壁时，4℃冰箱保存备用。

诱饵线虫的制备：取少许上述培养物于二层擦镜纸上置于漏斗（漏斗通过软管与收集管相接），加适量无菌水，挤压软管排除气泡，静置一定时间，直至滤出物达到需要量，取收集管中的滤出物，离心水洗三次，加无菌水至线虫浓度约为（2～3）×104条/mL。

1.3 培养基 玉米粉培养基（CMA）：玉米粉30g，琼脂16g，水1 000mL，自然pH值。玉米粉加水适量煮沸30min，四层纱布过滤，滤液加水至1 000mL，混匀，分装。121℃灭菌20～30min。主要用于捕捕食线虫真菌的分离、鉴定。

1.4 分离方法 诱饵平板法：用灭菌牙签将约2～3g样品挑到CMA平板上，加入线虫约5 000条做诱饵，每个样品三个重复。室温培养3～4周后，在解剖镜10～40倍下，对每个平板镜检。观察到捕食线虫真菌，用无菌牙签挑取其单个孢子，在酒精灯下迅速转接到60mmCMA平板上，并用此牙签在接入孢子地方的附近切掉一小块约0.5cm×1cm的培养基，形成以后用于观察捕食器的小观察室，然后置于25℃培养箱中或室温培养。

1.5 鉴定方法 利用立体解剖镜对已产生孢子和捕食器官的真菌进行鉴定；对未产生捕食器官的真菌，则挑单孢子于PDA培养基上进行纯化，再转于低营养的CMA培养基上，用高仁恒等〔15〕及苏鸿雁等〔16〕的方法诱导捕食器官产生，然后进行鉴定。

2 结果

分离培养结果：共分离到4种捕食线虫真菌，通过对其着生方式、孢子、捕食器官等的形态学观察、测定，分别为节丛孢属（Arthrobotrys）的少孢节丛孢菌（A.oligospora）和弯胞节丛孢菌（A.musiformis），单顶孢属（Monacrosporium）的椭圆单顶孢（M.ellipososporum）和白色单顶孢（M.candidum）。

3 讨论

本实验从鹿的新鲜粪便中分离出了4种捕食线虫真菌，其中A.oligospora的分出率为10%；A.musiformis的分出率为8%，M.ellipsosporum的分出率为7%，M.candidum的分出率为2%。此次粪便中捕食线虫真菌的检出率和种类与秦泽荣等〔17〕所作的新鲜牛粪中的相似，但比在土样及陈粪〔18〕中都少，原因是所采样鹿粪粪样单一，只是一个养殖场的，饲料单一，干草成分多，青饲料少，再加上由于动物消化道的消化作用和酸、碱、热等环境，随食物吃进去的捕食线虫真菌能抵御消化道恶劣环境并出现在粪便中的频率不高，同时新鲜粪便未接触土壤，减少了外界污染的概率。本研究直接从动物的新鲜粪便中分离出的捕食线虫真菌，理论上讲应具有抗消化能力，与从土壤中分离的捕食线虫真菌菌株相比，更有可能用于动物线虫病的生防，但需进一步进行生防效果实验。

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Isolation and Identification of Nematophagous Fungi from Free Faeces of Deer

YANG Lin,YANG Xiaoyan,LIYunxia,SU Hongyan*
（College of Agriculture and Bioscience,DaliUniversity,Dali,Yunnan 671003，China）

Four strains of nematophagous fungi belonging to Arthrobotrys and Monacrosporium were isolated from fresh faeces of deer in the present study.The fungiwere,respectively,identified as A.oligospora.A.musiformis,M.ellipososporum and M.candidum.. Themorphological features of the isolated fungiwere described in detail.

nematophagous fungi；isolation；identification；faeces of deer

Q938.1

A

1672-2345（2010）10-0040-03

国家自然科学基金资助项目（31060019）

2010-09-19

杨琳，讲师，主要从事微生物学和细胞生物学研究.

*通信作者：苏鸿雁，教授，E-mail：suhongyan16@yahoo.com.cn

（责任编辑 李 明）