超临界流体萃取红豆杉中有效成分的工艺优化*

唐 倩，杨元娟△，杨 宪

(1.重庆医药高等专科学校药学系 400030;2重庆赛诺药业股份有限公司 400041)

红豆杉为红豆杉科常绿乔木，其所含紫杉醇(Taxol)和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ(10-DABⅢ)成分是最有效的抗癌剂之一，10-DABⅢ也是化学合成紫杉醇的重要中间体，红豆杉所含黄酮成分中，如金松黄酮除抗肿瘤外，还有抗自由基和抗衰老的作用[1-5]。传统对紫杉醇等成分的提取有浸渍提取或渗漉法[5]。但容易造成有效成分的损失，为克服这些缺陷，本实验以有效成分紫杉醇、10-DABⅢ和总黄酮的收率为指标，对红豆杉的超临界流体萃取(supercriticalfluids extraction，SFE)工艺进行了优化。

1 材料与方法

1.1 材料 将红豆杉枝叶中粉于40℃减压干燥至恒重;样品经重庆市中药研究院张毅副研究员鉴定为红豆杉枝叶。

1.1.1 试剂 紫杉醇和芦丁标准品均购自中国药品生物制品检定所，10-DABⅢ标准品来自sigma公司。甲醇、乙腈为色谱纯(美国SK Chemicals公司)，CO2为医用级，其余试剂为分析纯，水为超纯水。

1.1.2 仪器 HA220-50-06超临界萃取装置(江苏南通华安超临界萃取有限公司)、RE-52A型旋转蒸发器 (上海亚荣生化仪器厂)、层析柱 (10 mm×200 mm)、UV-pc1800紫外光分光光度计 (北京普析)和高效液相色谱仪 (日本岛津2010AHT)等。

1.2 方法

1.2.1 SFE装置与操作 采用萃取釜为1 L的超临界CO2循环萃取设备[6-9]，原料每次用约200 g，加入适量夹带剂混匀并装入萃取釜中，升温加压到萃取需要的条件，静态浸泡一定时间，再在该温度和压力下使 CO2循环，流速为 15 kg/h。设定分离釜Ⅰ、Ⅱ的温度与压力均为50℃、8 MPa，在分离釜和萃取釜条件下，溶于超临界流体的成分因溶解度降低而分离出来，沉降在分离釜中，循环一定时间后，在分离釜底部接收萃取物并减压干燥，去除夹带剂，并对其中的主要成分进行含量测定。

1.2.2 样品测定 紫杉醇和10-DABⅢ采用柱层析，并用HPLC进行分析[10-12]，醇提取物或超临界提取物先用氯仿萃取除去低极性组分，40℃旋转蒸发至干，所得残渣通过装有等量硅胶G的层析柱，再以氯仿-甲醇或氯仿-异丙醇的体积比为99∶1或93∶7混合液洗脱，挥去有机溶剂后用适量甲醇溶解并用HPLC进行分析。对于总黄酮，以测定芦丁含量计算，采用UV法分析，将醇提物或超临界提取物置于50 m L容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.0 m L，混匀，放置6 min;加10%硝酸铝溶液1.0 m L，放置6 min;加4%氢氧化钠溶液10.0 m L，混匀，放置15 min，定容，供试品有絮状物，过滤，于 500 nm 波长处测定吸收度，同时准确称取芦丁对照品10 mg，加80%乙醇制成浓度为0.20 mg/m L的芦丁对照品溶液，在相同条件下测定吸收度，通过计算，得出总黄酮的量。

2 结果

本实验结果表明，SFE能够成功应用于红豆杉有效成分的萃取，尤当SFE以85%乙醇溶液作夹带剂、萃取温度为44℃、萃取压力为27 M Pa、动态循环时间为2 h时，为最佳萃取条件。在 SFE实验中，固定超临界 CO2的流速为15 kg/h，所用夹带剂与原料比保持不变，为0.7 m L/g原料，静态浸泡时间为0.5 h。

3 讨 论

在SPE实验中，观察所用夹带剂的种类以及组成、萃取温度、萃取压力和萃取时间对萃取效果的影响。

3.1 流体材料对SFE效果的影响 使用CO2作为萃取剂，其原因为:CO2有较适宜的临界条件和溶解度参数[13-15]，有机物溶解能力强，廉价易得，无毒，惰性，易于分离;且 CO2不会产生任何新的“三废”物质，利于环境保护[9]。

3.2 夹带剂种类对SFE效果的影响 选取萃取温度为50℃，萃取压力为30 M Pa，静态保持时间为0.5 h，根据紫杉醇、总黄酮和10-DABⅢ成分的挥发度和极性情况，选用4种夹带剂，分别为无水乙醇、85%乙醇、乙酸乙酯和丙酮，观察夹带剂种类对SFE效果的影响。结果表明:85%乙醇作夹带剂最利于3种成分的萃取。以无水乙醇为夹带剂对红豆杉SFE进行了研究，其效果优于传统浸渍或渗漉提取，而以85%乙醇作夹带剂萃取效果较无水乙醇好，其原因可能由于乙醇中的水具有较好的溶胀作用，带水的乙醇可以很好的透过萃取基质细胞壁;另外紫杉醇和10-DABⅢ均具有一定的极性，带水的乙醇因其极性较大，故对红豆杉成分的溶解度提高作用更显著;当以丙酮为夹带剂时，红豆杉枝叶中紫杉醇和10-DABⅢ提取效率比纯CO2增加不多，这可能由于夹带剂与溶质分子间主要是通过氢键起作用，乙醇比丙酮易于与溶质形成氢键，因而对萃取有较大的影响。

3.3 观察萃取温度对SFE效果的影响 选取萃取压力为30 MPa，静态浸泡时间为0.5 h，以95%的乙醇溶液作夹带剂，观察萃取温度对萃取效果的影响。结果表明:较低温度有利于紫杉醇和10-DABⅢ的萃取，说明温度升高导致超临界流体CO2分子间作用力减小，密度降低，故紫杉醇在其中的溶解度降低，虽温度升高紫杉醇与CO2分子的热运动加快，分子间缔和的机会增加，但对于紫杉醇和10-DABⅢ而言，温度升高萃取效果影响不明显;而对于总黄酮，温度的升高导致其饱和蒸气压的增大占据了主要影响，而超临界流体密度的减小对其萃取效果作用不明显;综合紫杉醇、10-DABⅢ及总黄酮的收率，选择萃取温度为44℃。

3.4 夹带剂组成对SFE效果的影响 选取萃取温度为44℃，萃取压力为30 MPa，静态浸泡时间为0.5 h，夹带剂乙醇的水溶液浓度在60%～95%变化，观察所用夹带剂乙醇水溶液的浓度对萃取效果的影响。结果表明:水的加入使超临界流体的极性增大，溶质在超临界流体中的溶解性发生变化;但水的加入又使红豆杉中水溶性的杂质更多的溶解出来。由实验结果可知:在选定温度、压力等其他条件不变的情况下，以85%乙醇水溶液作夹带剂有利于紫杉醇、10-DABⅢ和总黄酮成分的萃取。

3.5 萃取压力对SFE效果的影响 选取萃取温度为44℃，静态浸泡时间为0.5 h，夹带剂为85%乙醇，观察萃取压力对萃取效果的影响。结果表明:当萃取压力为27 MPa时，紫杉醇和总黄酮的萃取收率较高，低于27 M Pa时，超临界流体的密度较低导致紫杉醇在其中的溶解度较小，阻碍萃取的进行;高于27 MPa时，超临界流体的黏度较大，阻碍溶质在超临界流体中的传质。对于10-DABⅢ，在选定的温度下，高于27 MPa及小于31 MPa时，收率和含量仍随压力的升高而增大。

3.6 动态萃取时间对SFE效果的影响 适当地延长静态浸泡时间，有利于溶质在萃取溶剂与基质之间达到平衡，在萃取温度为44℃，萃取压力为27 MPa，夹带剂为 85%的乙醇溶液时，静态保持时间为0.5 h，动态萃取时间对SFE效果的影响，见图1。

图1 夹带剂种类对萃取效果的影响

图1表明:动态萃取时间延长至2 h时，紫杉醇和10-DABⅢ收率增大但在浸膏中含量降低，说明萃取的其他成分增多，总黄酮的收率和纯度均升高。故保持适当动态萃取时间较好。

表1 传统提取与SFE结果比较

3.7 SFE与传统提取方法的比较 将本研究优化的提取条件与传统提取方法进行对比[5]，结果见表1。由表1可知，SFE红豆杉中有效成分，显著优于传统提取方法。因而S PE研究为红豆杉的进一步开发和综合利用提供了新的依据。

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