体外产气法研究不同钾水平日粮对绵羊瘤胃发酵的影响

郭鹏举 高巍

近年来通过调控瘤胃发酵来提高反刍动物饲料转化率及生产性能一直是反刍动物营养研究的重点之一。钾对瘤胃微生物的生长以及瘤胃发酵都是必需的，不同钾水平的日粮在很大程度上影响了瘤胃发酵模式及动物的生产性能。20世纪90年代初以来，体外产气法由于能够较好地模拟瘤胃中的发酵历程和预测体内干物质消化率，已被广泛应用。但使用此方法研究不同钾水平日粮对绵羊瘤胃发酵影响的报道还很少。本试验以人工瘤胃产气量、瘤胃内pH值、NH3-N浓度、纤维酶活性、挥发性脂肪酸浓度以及干物质、NDF、ADF的消失率作为瘤胃发酵模式的环境指标，探讨不同钾水平日粮对瘤胃发酵的影响，为其在生产上的应用提参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物及饲养管理

本试验选用4头体重（40 kg左右）、年龄（2周岁左右）相近的健康新疆细毛羊羯羊为试验动物。常规舍饲喂养,日粮定量分早（8：00）、晚（20：00）两次喂给,自由饮水。

1.2 钾源

优级纯碳酸钾(≥99%)，江苏化工厂生产。

1.3 试验装置

玻璃注射器（国产，100 ml）及恒温培养箱。

1.4 试验设计

本试验采用单因素试验设计。将羊分为4组，饲喂相同钾水平的基础日粮。体外发酵底物用不同钾水平的日粮。A组为对照组（基础日粮），B组（基础日粮+538mg/kg），C 组（基础日粮+1 084mg/kg），D 组（基础日粮+1 631mg/kg），使四组的钾水平分别达到1.4%、1.8%、2.2%和2.6%。每个处理设3个重复。在体外发酵72 h后终止培养，分批测定培养液中pH值、NH3-N、VFA、DM、NDF和ADF降解率以及附着在底物颗粒上的纤维素分解菌的羧甲基纤维素酶活（CMCase）和木聚糖酶活（XYLase）。

混合精料配方见表1，日粮组成见表2。

表1 混合精料配方及营养水平

表2 体外发酵底物组成及营养水平(风干基础)

1.5 人工瘤胃微生物培养液组成

参考Menke等（1979）的活体外产气法进行配制，瘤胃液与人工培养液的比例为1：2，加入数滴0.1%的刃天青溶液（厌氧指示剂，有游离氧存在时呈红色，无氧时无色）。混合培养液，边加热边用磁力搅拌器进行搅拌，同时通入经除氧铜柱除氧的CO2直至溶液褪为无色。

人工培养液组成如下：

①微量元素溶液 A：CaCl2·2H2O 13.2 g；MnCl2·4H2O 10.0 g；CoCl2·6H2O 1.0 g；FeCl3·6H2O 8.0 g，加蒸馏水至100 ml。

②缓冲溶液 B：NH4HCO34.0 g；NaHCO335 g，加蒸馏水至1 000 ml。

③常量元素溶液 C：NaHPO45.7 g；KH2PO46.2 g；MgSO4·7H2O 0.6 g，加蒸馏水至 1 000 ml。

④刃天青溶液0.1%（w/v）：还原剂溶液（现配现用），1N NaOH 4.0 ml；NaS·9H2O 625mg；加蒸馏水至 95 ml。

将以上溶液按照下列顺序配制瘤胃微生物培养液：400 ml蒸馏水+0.1 ml溶液A+200 ml溶液B+200 ml溶液C+1 ml刃天青溶液+40 ml还原剂溶液，再加CO2饱和，并升温至39℃。

1.6 瘤胃内容物的采集

于早晨饲喂前2 h,由羊瘤胃内上下左右不同位点采集足量瘤胃内容物,将4只羊瘤胃内容物混合,灌入经预热达39℃并通有CO2的保温瓶中,灌满后立即盖严瓶口,迅速返回实验室,经4层纱布过滤后持续充入CO2气体5 min，保温,备用。

1.7 体外培养

准确称量0.2 g待测底物置于100 ml玻璃注射器（国产）中，加入30 ml保存于39℃水浴中含有CO2饱和的微生物培养液，空白管不加饲料样品。每个样本3个重复。排出培养液中气泡，密封，记录初始刻度后，置于39℃ 恒温培养箱中培养，分别记录0、1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、30、36、48、60、72 h 的气体产生量，当注射器的刻度达到80 ml时，排出气体至35 ml。

1.8 样品分析

1.8.1 pH值测定

在72 h将每组注射器分别取出3个，放入4℃的冰水中终止发酵,并用便携式pH计(雷磁PHS-3C型)测定各管瘤胃液的pH值。

1.8.2 DM、NDF、ADF消失率测定

发酵残留物用蒸馏水洗涤，4 800 r/min离心15 min，测干物质量，用减重法计算DM、NDF、ADF的消失率。

1.8.3 NH3-N浓度测定

离心后的上清液-20℃冷冻保存。用苯酚-次氯酸钠比色法测定NH3-N浓度（722型可见分光光度计）。

1.8.4 酶活

采用DNS显色剂法进行纤维素酶（羧甲基纤维素酶和木聚糖酶）的活性测定，用722型可见分光光度计测定吸光度。

1.8.5 VFA的测定

采用高效气相色谱法测定。

1.9 数据处理

采用Excel软件进行原始数据整理，用SAS中的NLIN模型计算产气速率、延滞期和最大产气量，方差分析采用SAS8.1软件中的One-way Anova进行，均值的多重比较采用Duncan's法进行，各组数据以平均数±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同钾水平日粮对绵羊产气量的影响（见表3、图1）

表3 不同钾水平日粮对72 h产气量的影响

由表3和图1可以看出，对照组A组、D组与B组、C组之间最大产气量差异极显著（P＜0.01）；A组和D组之间差异不显著（P＞0.05）；B组和C组之间差异也不显著（P＞0.05）。各组之间的产气速率的变化同最大产气量变化，且差异极显著（P＜0.01）。各组之间的延滞期没有显著差异（P＞0.05）。随着日粮中钾水平的增加，最大产气量和产气速率有提高的趋势，且在钾水平达到1.8%时产气量达到最高，在钾水平达到2.6%时最大产气量又接近于对照组。

2.2 不同钾水平日粮对绵羊瘤胃pH值、NH3－N浓度和酶活的影响（见表4）

由表4可看出，随着日粮中钾水平的增加，绵羊瘤胃pH值有先降后升的趋势，但各组之间差异并不显著（P＞0.05）；随着日粮中钾水平的增加，NH3－N 浓度与羧甲基纤维素酶活、木聚糖酶活各组之间差异也不显著（P＞0.05）。值得注意的是，羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活都在钾水平含量1.8%时活性达到最高（P＞0.05）。瘤胃pH值和NH3－N浓度却在钾水平含量1.8%时最低（P＞0.05）。

表4 不同钾水平日粮培养72 h后对瘤胃pH值、NH3－N浓度和酶活的影响

2.3 不同钾水平日粮对DM、NDF和ADF降解率的影响（见表5）

表5 不同钾水平日粮培养72 h后对DM、NDF和ADF降解率的影响（%）

由表5可以看出，随着日粮中钾水平的升高，DM降解率表现出先升后降，在钾水平达到2.2%时达到最高，但各组之间差异不显著（P＞0.05）；随着日粮中钾水平的升高，NDF也表现出先升后降，也在钾水平达到2.2%时达到最高，但各组之间差异也不显著（P＞0.05）；ADF的降解率在钾水平2.2%时达到最高，且与A组差异达到显著水平（P＜0.05），其他各组之间差异不显著（P＞0.05）。

2.4 不同钾水平日粮对瘤胃VFA的影响（见表6）

由表6可以看出，随着日粮中钾水平的升高，乙酸浓度在B组即钾含量为1.8%时达到最高，且与A组、D组差异显著（P＜0.05），其他各组之间差异没有达到显著水平；丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸浓度在钾水平1.8%时达到最高，但与其他各组间的差异并不显著（P＞0.05）；对于乙酸/丙酸值，钾水平 1.8%时最接近 3：1，但各组之间差异不显著（P＞0.05）。

表6 不同钾水平日粮培养72 h后对瘤胃VFA的影响

3 讨论

3.1 不同钾水平日粮对绵羊产气量的影响

Menke等提出的体外产气法能够较好地模拟瘤胃中的发酵历程，用产气法模拟瘤胃发酵，测定快速准确、重复性较好，设备要求低，操作简单，可以用来评定反刍动物饲料营养价值、瘤胃内能量载体物质和含氮物质释放的同步性、饲草料和不同来源营养物质的组合效应及瘤胃内发酵动态过程等。体外产气量主要与饲料碳水化合物的消化率高度相关，而与蛋白质的关联并不密切。本试验结果表明，随着日粮中钾水平的增加，最大产气量和产气速率有提高的趋势，且在钾水平达到1.8%时产气量达到最高，在钾水平达到2.6%时最大产气量又接近于对照组。原因可能是钾水平过高可能影响瘤胃液渗透压，从而影响了瘤胃微生物的生长和繁殖，使饲料的发酵效率下降。Warner和Stacy(1977)研究了用高钾离子导致瘤胃渗透压升高的试验，矿物质添加剂可造成瘤胃中离子和分子浓度升高，从而使瘤胃液渗透压升高。

3.2 不同钾水平日粮对瘤胃内环境的影响

瘤胃pH值是一项反映瘤胃内环境和发酵水平的综合指标，是食糜中挥发性脂肪酸与唾液中缓冲盐相互作用的结果，在活体内还要考虑瘤胃上皮对挥发性脂肪酸吸收以及随食糜流出等因素综合作用。当瘤胃pH值低于5.5时，瘤胃微生物蛋白的合成效率就会受到一定的影响（Calsamiglia等，2002）。本试验研究中四个试验组pH值在6.74～6.77范围内变动，变化幅度很小，均处于正常生理范围内（pH值5.5～7.5），不会影响人工瘤胃的发酵功能。pH值稳定的原因可能与瘤胃液的缓冲能力有关；pH值变化的原因可能是瘤胃微生物的活力受到钾水平的影响，产出的有机酸浓度不同造成的。

NH3－N是饲料蛋白质、肽、氨基酸、氨化物、尿素和其他非蛋白氮化合物分解的终产物，同时又是微生物合成菌体蛋白的原料，其浓度是反映瘤胃内氮源降解与微生物利用氨的动态指标。NH3－N浓度不仅受到饲料蛋白的影响,而且受饲料能量水平、氮在瘤胃内的吸收、微生物的利用以及瘤胃食糜进入后段消化道速度的影响。瘤胃微生物需要一定浓度的氨态氮,最佳浓度范围 6～30mg/100 ml（Preston 和 Leng，1987）。Satter和Roffler(1974)试验表明，氨态氮浓度小于2.5mg/100 ml时，发酵的“解偶联”作用引起微生物产量降低，生产效率下降，该值被广泛用作最低氨态氮浓度标准。本试验中氨态氮浓度均在正常范围内。

VFA是反刍动物赖以生存、保持正常生长、泌乳、繁殖的主要能源，可给反刍动物70%～80%的能量（Martin和 Van，1996），因此，VFA 浓度也是瘤胃发酵的主要指标之一。大量研究表明，对瘤胃pH值进行调控，可直接影响VFA的产生与利用，本试验中pH值变化不大，导致VFA变化也不大。在钾水平达到1.8%时，乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸浓度达到最大。而乙酸/丙酸值，均接近3：1，乙酸和丙酸处于相对平衡的状态。

3.3 不同钾水平日粮对饲料降解率及酶活的影响

钾在体内的功能主要是参与维持酸碱平衡和渗透压，还参与细胞内发生的代谢过程，特别是通过激活ATP酶参与碳水化合物代谢。钾在反刍动物瘤胃中的功能是在前胃内容物中保持一定的缓冲作用和水分水平，即造成供微生物发酵的适宜环境。Burrough(1951)发现钾是瘤胃微生物所必需的矿物元素之一，参与瘤胃微生物蛋白质的合成和酶的激活过程。钾对正常瘤胃微生物活动是必不可少的,尤其对分解纤维素的微生物更是不可缺少。Hubbert等（1958）研究表明,体外人工瘤胃培养时,随着钾添加量的增加,纤维的消化率明显提高。Phllipson（1953）研究结果显示，瘤胃液中钾含量为99～175mg/100 ml。本试验中，羧甲基纤维素酶活与木聚糖酶活都在钾水平含量1.8%时活性达到最高，但DM、NDF和ADF的降解率却在钾水平含量2.2%时最高，只是差异没有达到显著水平。影响酶活的因素主要有两方面，一是分泌酶的细菌受到破坏和抑制，二是酶活本身受到抑制。由于瘤胃微生物系统的高度复杂性，产生差异的因素很多。在本试验结果中与对照组相比，试验组的DM、NDF和ADF的降解率都比对照组高，这也说明高钾日粮能提高饲料的降解率，同一些学者的结果一致。

4 结论

家畜对钾的最大耐受量为占日粮干物质的3%。通过本试验可以知道，并不是饲料钾水平越高对瘤胃发酵越有利。本试验中在钾水平达到1.8%和2.2%时，最有利于绵羊瘤胃内发酵。

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