复合微生态酶制剂发酵玉米秸秆的研究

王 鑫 迟乃玉 董 硕 陈 璨 张庆芳

目前反刍动物养殖业饲料常用的是微贮饲料和青贮饲料，但是两者都有共同的缺陷——饲料营养价值低。提高反刍动物纤维质等粗饲料的转化率和利用率是提高饲料营养价值的重要途径，也是实现畜牧业跨越式发展的必要条件[1]。而复合微生态酶制剂则能解决这一问题，它们通过维持动物肠道内微生态平衡而发挥作用,具有促进动物生长发育,提高动物机体免疫力等多种功能,且无污染、无残留、不产生耐药性和对环境无害等,是一类新型绿色环保饲料添加剂。本文主要进行了反刍动物饲用复合微生态酶制剂发酵玉米秸秆的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

酵母菌 JM-BC、JM-29、JM-34、JM-66、JM-75，由大连大学生物工程学院微生物工程研究小组选育。

乳酸菌R4，由大连大学生物工程学院微生物工程研究小组提供。

1.1.2 培养基

①酵母菌保藏培养基：麦芽汁培养基。②乳酸菌保藏培养基：用葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.2%、酵母膏0.2%、琼脂1.8%、蒸馏水1 L，加热溶解后，每支8 ml量分装入18 mm×180 mm大试管中，121℃灭菌20 min，冷却，4℃冰箱保藏。③PDA固体培养基。④PDA液体培养基：a.PDA液体试管培养基（按照8 ml量分装入18×180 mm大试管中，121℃灭菌20 min，冷却，4℃冰箱保藏）；b.PDA液体小三角瓶培养基（按照25 ml量分装入100 ml三角瓶中，加入25粒玻璃珠，121℃灭菌20 min，冷却，4℃冰箱保藏）；c.PDA液体大三角瓶培养基（按照250 ml量分装入500 ml大三角瓶中，加入80粒玻璃珠，121℃灭菌20 min，冷却，4℃冰箱保藏）。⑤PDA斜面试管培养基。⑥乳酸菌固体试管培养基：同乳酸菌保藏培养基。⑦混菌发酵培养基：秸秆粉40 g、麸皮10 g、4倍的 Mandels营养盐水溶液（Mandels，1978）[2]，混匀后，取60 g混菌发酵培养基装入大罐头瓶中，用12层纱布封口，121℃灭菌20 min，冷却，4℃冰箱保藏。

1.2 实验方法

1.2.1 单一菌种发酵实验

1.2.1.1 培养方法

在PDA斜面试管培养基上轻轻挑取一环菌种，接种于PDA液体试管培养基中，30℃、180 r/min摇床培养24 h后，按5%接种量接种于PDA液体小三角瓶培养基中，30℃、180 r/min摇床培养24 h后，按照5%的接种量接种于混菌发酵培养基中，30℃静置培养，在发酵的第 1、2、3、5、7 d 分别测定 ADF 含量和蛋白质含量。

1.2.1.2 纤维素含量的测定

测定酸性洗涤纤维(ADF)（吴平等，1994）[3]。

1.2.1.3 蛋白质含量的测定

采用微量凯氏定氮法（吴平等，1994）[4]。

1.2.2 复合酵母菌发酵实验

JM-BC在PDA液体培养基中培养至24 h，JM-34在30℃发酵培养24 h，JM-66在PDA液体培养基中培养至24 h，JM-29和 JM-75在PDA液体培养基中培养至36 h。5种酵母菌按照1：1：1：1：1比例，共5%的接种量接种于混菌发酵培养基中，30℃静置培养，分别在发酵的第 1、2、3、5、7 d 后测定 ADF含量和蛋白质含量。

1.2.3 乳酸菌添加时间的研究

①菌种的扩培：在乳酸菌固体试管培养基上30℃静置培养36 h后，接种于装有8 ml麦芽汁液体培养基的大试管中，30℃静置培养36 h后，按5%的接种量接种于装有25 ml麦芽汁液体培养基的100 ml三角瓶中，30℃静置培养36 h后得发酵液。

②添加时间的设计：五种酵母菌混菌发酵24、36、48 h后分别按照5%的添加量添加乳酸菌发酵液，发酵3 d后，测定发酵产物中ADF含量和蛋白质含量并对发酵秸秆进行感观鉴定。

2 结果与分析

2.1 不同菌株发酵ADF含量的变化

五株酵母菌分别接种于混菌培养基后单独发酵和其按照1：1：1：1：1比例混菌发酵后，发酵产物中ADF含量随时间的变化如表1、图1。

表1 不同发酵菌株ADF含量变化（%）

由图 1 可见：JM-BC、JM-29、JM-75 发酵对纤维含量几乎没有影响；JM-66影响不大；JM-34发酵3 d后，纤维含量有明显下降；添加复合菌发酵后纤维降解率最大，发酵3 d后，ADF含量为41.2%，比对照降低10.2%。3 d后ADF含量降低不再明显，考虑到成本和发酵时间的长短，取3 d作为复合菌的发酵周期。可以看出添加各菌发酵后，纤维的降解率和各菌株发酵产生纤维素酶活的大小成正相关。

图1 不同菌株发酵ADF含量变化

2.2 不同菌株发酵蛋白质含量的变化

五株酵母菌分别接种于混菌培养基后单独发酵和其按照1：1：1：1：1比例混菌发酵后，发酵产物中蛋白质含量随时间的变化如表2、图2。

表2 不同发酵菌株蛋白含量变化（%）

由图2可以看出，添加复合菌发酵后发酵产物中蛋白的增加量最大，发酵3 d后，蛋白含量为9.03%，比对照增加11.3%。发酵3 d后的蛋白含量变化不大，分析原因可能是随着发酵的进行，复合菌中纤维素酶合成的减少，使得酵母生长必需的碳源减少，抑制酵母的生长，因而蛋白含量增加缓慢。

2.3 乳酸菌添加时间的确定

分别在五株酵母混菌发酵24、36、48 h后添加乳酸菌，共发酵3 d。实验结果如表3、图3。

图2 不同发酵菌株蛋白含量变化

表3 乳酸菌添加时间对发酵结果的影响

图3 乳酸菌添加时间对发酵结果的影响

由图3可以看出，五种酵母混菌发酵36 h后添加乳酸菌R4，发酵3 d后得到的发酵秸秆的粗纤维含量最低，ADF降解率为10.0%；蛋白含量最高，蛋白增加为11.5%。在酵母菌混菌发酵36 h后添加乳酸菌R4复合发酵3 d后效果最好。

3 结论与讨论

反刍动物饲用的复合微生态酶制剂发酵玉米秸秆，JM-BC在PDA液体培养基中培养至24 h，JM-34按照正交实验结果，30℃发酵培养24 h，JM-66在PDA液体培养基中培养至24 h，JM-29和 JM-75分别在PDA液体培养基中培养至36 h。五种酵母菌分别扩培后按照1：1：1：1：1比例共5%的接种量混菌发酵36 h,添加5%接种量的乳酸菌R4，复合发酵3 d后，产物蛋白含量提高11.5%，ADF含量降低10.0%。发酵产物产生复合的酒香味和酸香味，黄色，有光泽，无霉臭味，质地柔软，湿润蓬松。

根据微贮的作用机理、作用效果和微生态制剂对反刍动物的作用[5]，我们认为反刍动物饲用复合微生态酶制剂方面，以后研究中应该主要解决的问题有：第一，发酵工艺的优化，使调节反刍动物自身微生态平衡的菌株（主要是各种乳酸菌）和降解秸秆的纤维素及提高蛋白质含量的各种菌株[6]（主要是霉菌及酵母）能同时达到一个理想的作用效果（本课题已就此进行了研究）；第二，利用遗传操作等生物技术，通过转基因技术，筛选高效稳定的产酶菌株。

饲用复合微生态酶制剂对反刍动物具有促进饲料转化率、抗病、促进生长等作用[7]，而且生产成本低，发酵周期较之青贮和微贮短。因此，随着研究的进一步深入，新一代复合微生态酶制剂必将更加广泛应用于畜牧生产中[8]。

[1]陈碧祥,吴振强.饲料用酶制剂的开发与应用[J].粮食储藏,2002（5）:40-44.

[2]Mandels M.Cellulase Production by a new mutant strain of trichoderma reesei McG 77[J].Bioeng Symp,1978(8):89-101.

[3]吴平,周礼聪，等.食品分析(第一版)[M].北京:中国轻工业出版社,1994:198.

[4]吴平,周礼聪,等.食品分析(第一版)[M].北京:中国轻工业出版社,1994:216-219.

[5]帅丽芳,段铭,等.微生态制剂对反刍动物的影响 [J].饲料博览,2001（12）:36-37.

[6]陈翠微,刘长江,等.微生物发酵农作物秸秆生产蛋白饲料的研究与应用[J].微生物学通报,2002,279(4):291-292.

[7]那日苏,桂荣,赵青余,等.反刍家畜酵母培养物的研究[J].饲料研究 ,2004(01)：43-45.

[8]唐茂妍,王海彦,计成.最佳酶制剂应用体系（OEA）的理论与实践[J].饲料工业,2009，30(1):40-44.