铅抗性细菌的筛选及其对铅活化的研究

王旭梅，盛 楠，王红旗

（1.北京师范大学水科学研究院，北京 100875；2.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030）

铅在土壤中迁移转化能力弱、溶解度低，由于人类对铅的过度开采和使用，打破了铅在生态循环中的平衡，导致严重的全球性铅污染。因此，铅污染土壤的修复成为目前各国普遍关注的研究内容之一。随着研究的深入，人们发现超积累植物对沉淀态的铅无法吸收等缺点，限制了在实际生产中的应用[1-3]。而微生物对重金属的溶解作用在土壤污染修复中有很多用途，尤其是微生物繁殖迅速，不影响土壤的利用，可以方便地用遗传手段改造以增强其活力，应用前景广阔[4-5]。因此，可以提高植物富集土壤中重金属效能并环境友好的微生物强化措施得以提出。微生物通过自身代谢活动及产物促进重金属的溶解，提高重金属在土壤中的生物有效性，促进植物对重金属的吸收，此外微生物还能分泌植物激素促进植物旺盛生长、增大生物量、提高植物修复土壤重金属污染的效率[6-7]。

本研究从受重金属铅污染的土壤中筛选到2株产酸能力强、对铅有较强抗性的细菌，并对细菌活化沉淀态铅的环境影响因子进行分析研究，为供试菌株的实际应用及强化植物富集重金属铅等提供理论依据和试验材料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤

土样1（筛选菌种）：以五点法采集5～10 cm土层样品，分别取自北京焦化厂和首钢段永定河岸边，含 Pb 量在 48～85 mg·kg-1之间。

土样2：供试土样采自北京沙河区菜园，土壤主要理化性质为有机质含量1.09%，速效氮含量37.25 mg·kg-1，速效磷 8.56 mg·kg-1，速效钾 80.21 mg·kg-1，pH 6.8。将供试土样风干、磨细过100目筛，在32只铝盒中均等地放入土样，每盒土样均为6.00 g，然后于130℃烘箱，干热灭菌3 h。

1.1.2 试验药品

硝酸铅分析纯、碳酸铅分析纯均购自北京市化工技术有限公司。

1.1.3 培养基

有氮培养基：蔗糖 10 g，（NH4）2SO41 g，K2HPO42 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1 g，酵母膏0.5 g，CaCO30.5 g，蒸馏水1 L，pH 7.2，琼脂20 g。Pb（NO3）2配成 104mg·L-1的溶液单独灭菌，然后与培养基混合倒平板，Pb2+的浓度分别为100、200、400、800 mg·L-1。液体培养时不加CaCO3和琼脂[8]。

1.2 试验方法

1.2.1 铅抗性菌株分离筛选及初步鉴定

经10倍稀释法，将10-4、10-5、10-6的土壤稀释液分别涂布于固体有氮培养基上[9]，28℃恒温培养2 d，逐步提高培养基中的铅离子浓度，挑取含铅量为800 mg·L-1的有氮培养基中生长丰满的单菌落，随着不断移植，杂菌被慢慢淘汰，而得到比较纯的菌种[10]，于4℃下保存。将分离所得的菌株活化18 h，接入2%重金属铅抗性筛选液体培养基中，摇床培养48 h后用pHS-3C型pH计测定pH，观察试管底部沉淀态铅的变化，同时镜检。选出两株pH变化明显、铅沉淀物减少、生物量高的菌株（JH13和Y7）作为以下试验的材料。

1.2.2 菌株JH13和Y7对培养液中沉淀态铅的活化试验

在250 mL三角瓶中装入100 mL有氮液体培养基，加入PbCO30.02 g，使其浓度在铅全部溶解的条件下：Pb2+为400 mg·L-1，115℃高温湿热灭菌20 min。供试菌株接种于以上培养基，在30℃、120 r·min-1摇床预培养2 d，以未接种的重金属培养液为对照，分别在12、24、48、72 h取样，用pH计测定接菌培养液中pH，以确定其代谢产酸能力；培养液离心（10 000 r·min-1，3 min）使菌体和未活化的重金属沉淀，取上清液，原子吸收法测上清液中Pb2+浓度；同时测定对照的pH、Pb2+浓度。

1.2.3 菌株JH13和Y7对土壤中沉淀态铅的活化试验

在无菌工作台上，将称取的PbCO30.02 g与经过干热灭菌的土样2混匀倒入50 mL三角瓶内，共准备32瓶（每个菌种16瓶），每株菌随机分成4组，每组4瓶。先将以纯化的菌株活化18 h，然后接种于50 mL三角瓶中，每瓶接菌6 mL，每组只接种3瓶，另1瓶不接菌，用作对照。培养及测定方法同培养液中铅的活化试验，只有培养液离心时间不同（10 000 r·min-1，5 min）。

2 结果与分析

2.1 铅抗性菌株分离筛选及初步鉴定

从含Pb2+100 mg·L-1的培养基中分离得到19株抗性菌株。逐步提高Pb2+浓度，在含Pb2+800 mg·L-1的培养基中生长良好的细菌共4株。以代谢产酸及活化铅沉淀物能力强、生长势及抗逆性强为复筛条件，筛选出2株高效铅抗性菌株（菌株JH13和Y7），通过形态学特征、生理生化特征等分析[11]，初步鉴定菌株JH13属于芽胞杆菌属（Bacillus）、Y7属于节杆菌属（Arthrobacter）。

2.2 抗性细菌对培养液中沉淀态铅的活化试验

由图1、2可以看出，经过摇床培养后两株菌分别使含PbCO3培养液中的沉淀态铅发生变化，随时间的延长，培养液的pH逐渐降低，活化铅含量逐渐升高，而未经菌液处理的对照培养液中沉淀态铅含量和pH，基本保持不变。24 h之间，与对照相比，两株菌对铅的活化量，都成正比例升高，但24～48 h之间，活化量急剧增加，为前24 h活化总量的2倍之多，此时，培养液的pH急剧降低与活化态铅的变化成负相关，JH13的pH由6.1降至4.2，Y7的pH由5.9降至4.0。由此可知，供试菌株JH13和Y7对沉淀态铅有很强的活化效能，其活化作用与供试菌株的代谢产酸能力相关。

图1 抗铅细菌JH13对培养液中PbCO3的活化Fig.1 Activation of PbCO3in liquid culture medium by lead-resistant JH13 strains

图2 抗铅细菌Y7对培养液中PbCO3的活化动态Fig.2 Activationd developments of PbCO3in liquid culture medium to lead-resistant Y7 strains

由表1可看出，与对照相比， JH13活化铅含量始终高于Y7，24 h至48 h之间，JH13的活化量大于Y7，但48 h之后，JH13的活化量有所降低，而Y7仍小幅上升。造成这种现象的原因，可能与菌株本身吸附一部分Pb2+或与代谢产物有关。

表1 经抗性细菌处理后上清液中可溶性Pb2+含量Table 1 Concentration of soluble Pb2supernatants through resistant treatment （mg·L-1）

2.3 抗性菌株对土壤中沉淀态铅的活化实验

将两株菌接入含PbCO3的土样2中，由表2可看出，JH13对沉淀态铅的活化量高于Y7。由图3可看出，pH变化曲线与对照相比有较大幅度的降低。由此发现，不论在培养液中还是在土壤中，皆是JH13对铅的活化量高于Y7、皆是pH变化曲线趋势逐渐降低，但菌株对沉淀态铅的活化量始终低于培养液中的活化量。由此进一步说明，菌株对重金属沉淀态铅的活化，不仅与代谢产酸有关，还可能与菌体生活环境等有相关性。JH13、Y7对土壤pH的影响（菌体本身的pH基本是稳定的，只能是其活动改变外部环境的pH）。

表2 两株供试菌株对土壤中沉淀态PbCO3的活化量Table 2 Activation of precipitation fraction PbCO3in soil by two strains tested （mg·L-1）

图3 两株供试菌株在土壤中的pH变化曲线Fig.3 Change curve of pH of two bacterial strains tested in soil

3 结论

a.从受重金属污染场地的土壤中分离筛选出两株高效活化沉淀态铅的细菌（JH13和Y7），初步鉴定属于芽孢杆菌属和节杆菌属。

b.分别在培养液和土壤中，投入菌株的活化研究结果研究表明，两株菌对沉淀态铅都有很强的活化效能，且活化量高于对照达2倍之多。

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