Htra2基因内含子5-59A/G位点多态性与帕金森病的相关性研究

赵西耀,陈煜森,何芳梅,赵磊,刘梁芳,潘剑罡,赵斌

Htra2(High temperature requirement A2),也称作Omi,是Htra丝氨酸蛋白酶家族的一个新成员,在大部分的正常组织器官中都有其表达。该基因位于人类染色体2p13.1。Htra2是一类较为特殊的蛋白质,它既具有诱导凋亡的蛋白酶活性,同时还是分子伴侣,具有细胞保护作用。Htra2既可以通过氨基末端的Reaper样基序[Ala-Val-Pro-Ser(AVPS)]与凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)相互作用来诱导凋亡,亦可以通过caspase非依赖性,即直接利用其蛋白酶活性发挥促凋亡作用[1]。推测Htra2缺乏时将导致机体发育过程中某些应该凋亡消失的细胞不能够自然崩解而致病[2]。另一方面,Krick等通过H tra2基因靶向删除等方法发现,鼠对氧化应激反应更敏感,推测Htra2在神经元内的主要角色可能是对抗应激的神经保护作用,并认为Htra2发挥抗凋亡或促凋亡活性,取决于所在的亚细胞结构和相互作用蛋白,在线粒体中以抵抗氧化应激的细胞保护作用为主;在胞浆中,以诱导细胞凋亡作用为主[3]。

自1977年发现内含子以来,内含子功能的研究一直受到人们的关注。在许多基因的内含子中均发现基因表达的调控元件,其中大多为增强元件,可以调控转录的起始来增强基因的表达;此外,一些内含子在基因的表达中起抑制作用;一些基因的内含子突变会引起基因表达效应的变化。单核苷酸多态性是一种重要的遗传标记。已经发现Htra2基因多个单核苷酸多态性位点与帕金森病相关[4-5]。Htra2基因内含子5-59A/G(rs2241027)位点的多态性(等位基因为A和G)与帕金森病关系的研究在国内外尚未见报导。我们在粤西地区汉族人群中检测Htra2基因内含子5-59A/G位点频率的分布特点,并分析其基因多态性与帕金森病的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 2004年3月～2008年9月本院神经内科住院的帕金森病患者56例作为病例组,其中男性35例,女性21例;年龄50～89岁,平均(67.91±9.80)岁。均为粤西地区的汉族人。所有病例均按照2006年中华医学会神经病学分会帕金森病及运动障碍学组讨论决定的帕金森病诊断标准进行选择,并排除非帕金森病的诊断。本院健康体检者109例作为对照组,其中男性68例,女性 41例;年龄52～86岁,平均(68.62±8.31)岁。均为汉族人,无帕金森病病史。两组间男女比例(P=0.627)、平均年龄(P=0.627)均无显著性差异。

所有标本的收集均经其本人或家属同意,并经广东医学院医学研究伦理委员会同意。

1.2 DNA的提取和Htra2基因的分型 取早晨空腹静脉血5 ml,3.8%柠檬酸钠抗凝,碘化钾法提取外周血白细胞的DNA。用聚合酶链反应-限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)法检测病例组和对照组全部样本Htra2基因内含子5-59A/G位点的多态性。根据5-59A/G位点及其两侧的DNA序列用Primer 5.0引物设计软件设计引物,用 NEBcutter V2.0设计Bsp1268I限制性内切酶,根据酶切片段条带的不同分析其基因型和多态性。

引物由上海生工合成,上游引物:5′-TGT GGG AAG GGT AGG TT-3′,下游 引物 :5′-GGA TGG CAA AGG AGA TT-3′。PCR反应体系 13.02 μL,其中包括 10×Buffer 1.15 μL,dNTP(10 mmol/L)1.0 μL,引物(20 μ mol/L)0.25 μL,基因组 DNA 1.0 μL,Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.12 μL,H2O 9.25 μL。PCR 反应条件:94℃,热变性5 min,94℃45 s,退火54.6℃44s,延伸72℃42 s,扩增32个循环后延伸72℃10 min,终止反应 。取 PCR 扩增产物 2 μL、NEB Buffer 0.5 μL、Bsp1268I 0.25 μL、三蒸水 2.25 μL,使总体系为5 μL,30℃酶切7 h,进行8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。100 V电泳4 h后用银染法染色,观察结果。含有Htra2基因5-59A/G的PCR产物是241 bp,经Bsp1268I酶消化后产生两个片段分别是 123 bp和118 bp两端大小片断。杂合子AG基因型则有3个片段,分别为241 bp、123 bp和 118 bp;纯合子AA 基因型则只有1个片断,大小241 bp;纯合子GG基因型有2个片断:123 bp和118 bp。

1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件和遗传学数理统计方法对所有资料进行统计分析。基因型和等位基因频率采用直接计数法统计。研究对象与Hardy-Weinberg平衡的符合程度、基因型和等位基因频率的组间比较采用四格表χ2检验,计量资料用两样本均数t检验分析,显著性水平α=0.05。

2 结果

Htra2基因内含子5-59A/G位点上从A到G的突变产生了Bsp1268I限制性内切酶的酶切位点。酶切该多态性位点的PCR产物后电泳图如下。

图1 5-59A/G位点扩增片段 Bsp1286I酶切产物电泳图

病例组(χ2=0.091,P=0.956)与对照组(χ2=0.920,P=0.337)人群中Htra2基因内含子5-59A/G位点的基因型分布经Pearson χ2检验均符合Hardy-Weinberg平衡,表明Htra2基因内含子5-59A/G位点的基因型分布在所研究的人群中已达到了遗传平衡。病例组和对照组 3种基因型频率分别是:AA:21.4%(12/56),AG:50.0%(28/56),GG:28.6%(16/56)和AA:11.0%(12/109),AG:51.4%(55/109),GG:37.6%(42/109)。AA基因型及等位基因A与帕金森病均有相关倾向。见表1。

表1 两组Htra2基因内含子5-59A/G位点多态性[n(%)]

经性别分层后,男性病例组A等位基因频率略高于对照组(P=0.051),OR=1.788,95%CI:0.994～3.217。病例组AA基因型频率高于对照组(P=0.041),OR=0.332,95%CI:0.112～0.985。在女性中,病例组的A等位基因频率与对照组无显著性差异(P=0.681),OR=1.172,95%CI:0.551～2.494。GG基因型也无显著性差异(P=0.657),OR=1.296,95%CI:0.412～4.077。见表2。

表2 两组不同性别5-59A/G位点多态性[n(%)]

3 讨论

帕金森病(Parkinson's disease,PD)是常见于中老年人的进行性神经系统变性疾病,以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为特征。帕金森病病因迄今不明,目前普遍认为多种因素可能参与帕金森病的发病,遗传因素可使患病易感性增加。Htra2作为一种核编码线粒蛋白酶,在内质网中合成,在线粒体膜间隙储存。当细胞受到刺激发生应激反应时,线粒体膜通透性增加,Htra2分子从线粒体释放并进入细胞质和/或细胞核中。在胞质中,它通过N端4残基IAP结合要区结合IAP的杆状病毒IAP重复结构域,通过破坏caspase-IAP复合物,和/或诱导IAPs的自动泛素化和降解,促进了caspase-3、7、9活性,因而解除了IAPs对caspases的阻止,诱发凋亡。同时还可借自身的酶活性切割、降解 IAPs[6]。另外,Htra2还具有caspase非依赖的致凋亡作用[1],其作用机制还有待研究。另外,通过Htra2基因靶向删除、转基因表达、免疫印迹、测定细胞膜电位等方法,发现鼠Htra2基因靶向删除对氧化应激反应更敏感,与对照组比较更易诱导细胞凋亡。神经元特异性Htra2过表达的转基因鼠并没有出现神经元凋亡增加,也并未出现表型异常,推测Htra2在神经元内的主要角色可能是对抗应激的神经保护作用[3]。近来还发现其对Parkin相关的泛素蛋白酶体有重要的影响[7],及参与氧化磷酸化过程[8]。

近年来,其基因突变与帕金森的相关性研究成亦受到了人们的重视。Strauss等对414例帕金森患者和331例健康人的G421T多态性相关性研究发现,病例组中有26例杂合子个体(6.2%),对照组中只有10例(3%),并验证了A141S基因多态性与帕金森病呈显著性相关(P＜0.05),同时没有发现突变的纯合子携带者;相比之下,在4个散发性的帕金森病患者中得到确认的G1195A的替代,在健康对照的740条同源染色体中却没有发现。他们还在原发性帕金森病患者大脑Lewy小体中检测到了Htra2分子;同时观察到编码Htra2的基因发生突变时,引起了与帕金森病特征相同的神经变性[4]。Bogaerts等通过突变分析等方法验证了 Htra2的 PDZ区域的一个新的突变位点Arg404Trp,该位点的突变预测将失活Htra2。通过荧光素酶报告基因分析的数据,测序等方法,在可能影响Htra2表达的5′和 3′区域,验证了 6个患者特异性突变体,并推测此突变可能影响了其转录活性[5]。但也有无相关性的报道[9]。实验结果不一致可能是由于种族、地区、试验方法、结果的判定等因素的差异引起。

近年来,人们对内含子的功能提出许多新的见解[10]:①内含子通过启动子、起始位点的碱基配对,可以阻止或增强RNA聚合酶的作用;②内含子具有各种剪接信号,不同的细胞可以选择不同的拼接点,对外显子进行有选择地拼接,形成不同的成熟mRNA;③内含子也许有自已特定的蛋白质编码。内含子可以对基因表达起增强或抑制作用。

本研究所选Htra2基因5-59A/G位点处从G到A的突变导致了Bsp1268I酶的限制性酶切位点。我们检测了粤西地区56例帕金森患者和109例健康人的H tra2基因内含子5-59A/G位点的基因型,分析其基因型和等位基因频率分布以及它们与帕金森病之间的关联性。结果显示,H tra2基因内含子5-59A/G位点的AA基因型及等位基因A与帕金森病均有相关倾向;在经过性别分层后,男性AA基因型与帕金森病具有相关性,而Htra2基因5-59A/G多态性与女性帕金森病发病无关。结合内含子的功能特点,推测该位点与帕金森病的相关性可能是通过影响基因分子构象转录时剪切位置,和/或影响与相应蛋白结合,进而影响基因转录的起始和延伸等过程,影响了Htra2的蛋白酶活性,最终促进了帕金森病的发生。相关性局限于男性,可能因性激素等引起。尚有待进一步研究证实。

本研究的样本较小,其代表性与普通人群可能有差异,因此有必要对 Htra2基因位点内含子4之5-59A/G位点进一步深入研究,以正确评价其多态性在帕金森病中的作用机制和临床应用价值。

[1]Okada M,Adachi S,Imai T,et al.A novel mechanism for imatinib mesylate-induced cell death of BCR-ABL-positive human leukemic cells:caspase-independent,necrosis-like prog rammed cell death mediated by serine protease activity[J].Blood,2004,103(6):2299-2307.

[2]Yang H,Zhou HY,Li B,et al.Neuroprotection of Parkin against apoptosis is independent of inclusion body formation[J].Neuroreport,2005,16(10):1117-1121.

[3]Krick S,Shi SL,Ju WJ,et al.Mpv17l protects against mitochondrial oxidative stress and apoptosis by activation of Omi/Htra2 protease[J].Proc Natl Acad Sci,2008,105(37):14106-14111.

[4]Strauss KM,Martins LM,Plun-Favreau H,et al.Loss of function mutations in the gene encoding Omi/HtrA2 in Parkinson's disease[J].Human Molecular Genetics,2005,14(15):2099-2111.

[5]Kieper N,Holmströ m KM,Ciceri D,et al.Modulation of mitochondrial function and morphology by interaction of Omi/HtrA2 with the mitochondrial fusion factor OPA1[J].Exp Cell Res,2010,316(7):1213-1224.

[6]Alnemri ES.HtrA2 and Parkinson's disease:think PINK?[J].Nature Cell Biol,2007,9(11):1227-1229.

[7]Park HM,Kim GY,Nam MK.The serine protease HtrA2/Omi cleaves Parkin and irreversibly inactivates its E3 ubiquitin ligase activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,387(3):537-542.

[8]Johnson F,Kaplitt MG.Novel Mitochondrial substrates of Omi indicate a new regulatory role in neurodegenerative disorders[J].PLoS One,2009,4(9):e7100.

[9] Simón-Sánchez J,Singleton AB.Sequencing analysis of OMI/HT RA2 shows previously reported pathogenic mutations in neurologically normal controls[J].Hum Mol Genet,2008,17(13):1988-1993.

[10]Clancy M,Hannah LC.Splicing of the maize Shl first intron is essential for enhancement of gene ex pression,and a T-rich motif increases expression without afecting splicing[J].Plant Physiol,2002,130(2):918-929.