RASSF1A基因在结直肠癌中的表达及临床意义

朱崎 肖伟升 欧瑜 廖爱军

RASSF1(Ras-assotiation domain family1)即Ras相关区域家族1基因，是Dammann以及 Lerman分别在2000年从肺癌细胞株3号染色体短臂克隆的新型候选抑癌基因[1-2]，它有多种不同mRNA剪接体，包括RASSF1A/B/C。研究表明，RASSF1A在所有的正常组织中均表达，但是在肺癌、乳腺癌、鼻咽癌、肾癌、前列腺癌和膀肤癌等绝大多数肿瘤中却表达缺失，目前研究表明，胃癌中46%癌组织和33%的细胞系中存在RASSFIA表达缺失，与肿瘤分级、分期有关，但与组织学类型无关[3]。有作者研究胃癌、胃腺瘤、肠上皮化生、慢性胃炎四种病变的甲基化谱，发现RASSFIA启动子甲基化只见于胃癌中[4]。这些研究结果提示RAssFIA表达缺失在胃癌发生发展中是常见事件，可能在胃癌发生发展中扮演了重要角色。但RASSF1A基因与结直肠癌是否相关尚未见相关报道。本实验通过RT-PCR检测结直肠癌中RASSF1A的表达水平探讨RASSF1A基因与结直肠癌的关系。

1 材料及方法

1.1 病例标本来源 来自2009年5月～9月我院肿瘤外科结直肠癌手术患者，共40例，40例病例中男24例，女16例，年龄在26～68岁。所有标本均经两名高年资病理医师阅片确诊，取距离肿瘤边缘5cm外组织作为正常对照。所有标本均保存在-180℃液氮中待用。组织标本按TNM分期。按组织分化分级。

1.2 组织总RNA的提取 按照Trizol试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)操作说明书提取总RNA。

1.3 逆转录合成cDNA 按照AMV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工)操作说明书，取上述提取的总RNA5μl、Oligo(dT)12～181μl、去离子水6μl，共置于PCR管中，涡旋器上轻微混匀3～5s，以上均冰上操作。70℃孵育5min后，冰上冷却，4000r/min离心10s。然后分别加入5×反应缓冲液4μl，RNA酶抑制剂(20u/μl)1μl，10mmol/L)dNTP2μl，混匀，4000r/min离心10 s，收集产物。42℃孵育5min。加AMV逆转录酶(200u/μl)1μl,终体积为20μl。42℃孵育60min。70℃加热10min。置-20℃保存。

1.4 PCR扩增 根据相关文献合成扩增RASSF1A的引物：上游引物5′-TCT GGG GCG TCG TGC GCA AA-3′，下游引物5′-GAA CCT TGA TGA AGC CTG TG-3′，扩增产物长285bp；以在各种组织中稳定表达的β-actin作为内参，上下游引物分别为：5′-ACC CAG ATC ATG TTT GAG ACC-3′，5′-GGA GTT GAA GGT AGT TTC GTG-3′，扩增产物长486bp。按照PCR扩增试剂盒(上海生工)的操作说明书进行。反应条件：95℃预变性4min；95℃变性30sec；60℃退火30s，72℃延伸1min，共32个循环；72℃延伸5min。产物置-20℃保存。

1.5 琼脂糖电泳 扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，用BIO-RAD图象分析仪扫描记录。

1.6 统计学方法 采用x2检验和秩和检验。

2 结果

2.1 RASSF1A基因在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达RASSF1A mRNA在40例结直肠癌组织中有90.0%(36/40)表达缺失；而只有12.5%(5/40)癌旁正常组织中存在表达缺失，差异有统计学意义(P＜0.05)。见图1。

2.2 RASSF1A基因在结直肠癌中的表达与组织分化、临床病理的关系RASSF1A基因mRNA表达缺失与结直肠癌组织分化程度可能不相关，高分化、中分化、低分化比较无统计学差异(P＞0.05)，与结直肠癌病理分期可能不相关，病理分期间比较无统计学差异(P＞0.05)。见表1。

图1 RASSF1A基因在结直肠癌中的表达

3 讨论

RASSF1A目前被认为是一个新型的抑癌基因，首先在肺癌中发现，并且随着对RASSF1A基因研究的不断深入，人们发现RASSF1A通过多种途径抑制肿瘤的形成，而其失活参与了肿瘤的发生、发展过程，研究已经在乳腺癌，前列腺癌，鼻咽癌，卵巢癌，黑色素瘤，淋巴瘤，膀胱癌，胃癌等肿瘤中发现了RASSF1A的表达缺失或表达下调。

表1 RASSF1A基因mRNA在结直肠癌中的表达

RASSF1A被认为是一种Ras效应分子，通过RAS结构域与Ras-GTP结合，诱导细胞凋亡[5]。在正常的细胞中，Ras的这两种效应可能通过动态的平衡来维系细胞正常生长，而在肿瘤中因甲基化所引起的RASSF1A表达缺失可能使Ras更多的发挥促进细胞生长效应而最终导致肿瘤发生。PallarésJ等[6]在子宫内膜癌的研究中发现RASSF1A通过Ras-MAPK通路影响细胞增殖及凋亡。YooYA等[7-8]发现RASSF1A能抑制H-Ras诱导的JNK活性。Thaler等[9]在最近的研究中发现RASSF1A能调节Ras介导的Raf-MEK-ERK信号通路，从而影响细胞周期及衰老。RASSF1A作为Ras的一种效应分子已经得到证实。而进一步研究表明RASSF1A可通过MST1(Mammalian sterile20likekinase 1)[10-12]、支架蛋白CNK1(connector enhancer of KSR)[13]、MOAP1(modulator of apoptosis-1，一种Bax结合蛋白)[14-16]、Cyclin D1(细胞周期蛋白D1)[7-17]、CDC20(cell division cycle control protein20,细胞分化周期调控蛋白20)[18-19]影响细胞的凋亡，并且认为RASSF1A还能通过ATM磷酸化位点调节细胞稳定性[20-21]。

这些研究表明了RASSF1A基因能抑制肿瘤的生长，诱导凋亡，是肿瘤的发病机制，但RASSF1A基因是否在结直肠癌中也存在着表达缺失，RASSF1A基因是否是结直肠癌的抑癌基因，目前国内外尚无研究。我们的实验结果表明：结直肠癌旁组织的RASSF1A基因mRNA表达的缺失率(90%)明显高于癌组织(12.5%,P＜0.05)。这说明RASSF1A基因可能与结直肠癌相关，并且可能是结直肠癌的一个抑癌基因。进一步研究表明：RASSF1A基因的表达与结直肠癌的组织分化及病理分期间无明显关系(P值均＞0.05)这可能说明RASSF1A基因与结直肠癌的组织分化及病理分期关系不大，但也有研究表明在RASSF1A基因与胃癌的进展相关，RASSF1A基因是否确定与结直肠癌的组织分化及病理分期无关，需进一步扩大标本量来证明。

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