青春双歧杆菌工业化培养基以及生长条件的筛选

刘 韩，关 宏，杨文钦，王慧荣，张 琪，刘吉成

（齐齐哈尔医学院微生态工程技术中心，黑龙江 齐齐哈尔 161006）

双歧杆菌（Bifidobacteria）是健康个体肠道中的优势菌，在人的一生中与人始终保持着共生关系。研究表明，双歧杆菌具有调整肠道菌群[1-2]、防止便秘、降低结肠癌的发病率[3]、产生抗菌素[4]、增强免疫系统[5]、缓解乳糖不耐症以及降低胆固醇等功效[6]。由于在人类生理方面发挥的重要作用，双歧杆菌现已成为商业上优选的益生菌。其中青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentic）是青年个体肠道中的优势菌，对人体产生许多益生作用。但由于青春双歧杆菌对氧非常敏感，对低pH的抵抗能力差，并对营养要求苛刻，在获取高活菌数培养物时有一定困难。Annan等研究指出凝胶微球包囊法能够改善青春双歧杆菌暴露在胃肠道时的存活率[7]；许多研究报道添加蛋白胨、半胱氨酸、酵母浸出物、寡聚糖等营养物质可以提高双歧杆菌的活菌数[8-11]，但成本过高、操作繁琐，不适合大规模生产使用。田寒友等曾对一株长双歧杆菌进行了工业化培养基的筛选[12]。然而，青春双歧杆菌工业化培养基方面的相关报道很少。本文筛选了几种价格低廉的商业化产品作为青春双歧杆菌生长所需碳源和氮源，筛选出了青春双歧杆菌工业化培养基成分。利用此培养基优化了对青春双歧杆菌活菌数的影响的接种量、培养温度和培养时间一系列生长条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与试剂

青春双歧杆菌23001，现保藏于齐齐哈尔医学院微生态工程技术推广中心。

完达山脱脂乳粉，ALPAVIT乳清粉，葡萄糖，双歧因子A（购自于江门量子高科生物有限公司）；双歧因子B（购自于大庆日月星有限公司）。

1.1.2 培养基

改良MRS培养基（MRS培养基中添加0.5%半胱氨酸），双歧杆菌培养基0233，10%脱脂乳培养基。

1.1.3 仪器与设备

SHEL LAB公司厌氧培养箱，上海博迅实业有限公司高压蒸汽灭菌器，梅特勒-托利多pH计，奥林巴斯电子显微镜。

1.2 方法

1.2.1 菌种的活化

在厌氧条件下，利用双歧杆菌培养基0233对青春双歧杆菌冻干粉进行复苏，37℃厌氧培养48 h；按5%（V/V）的接种量接种到10%脱脂乳中，37℃厌氧培养24 h。菌种放置在4℃冰箱保存，每次试验前活化1次。

1.2.2 活菌数的测定

菌落总数按GB/T 4789.2-2003规定的平板菌落计数法进行测定。菌液以10倍梯度稀释，用改良MRS培养基倾注到稀释液平皿中，37℃厌氧培养72 h。

1.2.3 菌液pH值的测定

利用pH计测定。

1.2.4 青春双歧杆菌工业化培养基成分的筛选

以双歧因子A、葡萄糖、乳清粉、双歧因子B、脱脂乳这几种价格低廉的商业化产品作为培养基成分，每次选择其中一个因素做单因素试验，5%接种，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数及pH值。

1.2.4.1 双歧因子A含量的确定

以 8%（W/V）脱脂乳、1%（W/V）双歧因子 B、1%（W/V）乳清粉和1%（W/V）葡萄糖为基础培养基，分别添加0、0.5%、1%和2%（W/V）的双歧因子A，5%接种，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数、pH值。

1.2.4.2 葡萄糖含量的确定

以8%脱脂乳、1%双歧因子A、1%乳清粉和1%双歧因子B为基础培养基，分别添加0、0.5%、1%和2%的葡萄糖，5%接种，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数及pH值。

1.2.4.3 乳清粉含量的确定

以8%脱脂乳、1%双歧因子A和1%双歧因子B为基础培养基，分别添加0、0.5%、1%和2%的乳清粉，5%接种，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数及pH值。

1.2.4.4 双歧因子B含量的确定

以8%脱脂乳、1%双歧因子A为基础培养基，分别添加0、0.5%、1%和2%的双歧因子B，5%接种，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数及pH值。

1.2.4.5 脱脂乳含量的确定

以1%双歧因子A、1%双歧因子B为基础培养基，分别添加4%、6%、8%和10%的脱脂乳，5%接种，37℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数及pH值。

1.2.5 生长条件的优化

1.2.5.1 最佳接种量的确定

在筛选出的工业化培养基中分别接种1%、3%、5%和7%（V/V）的菌种（菌种活菌数为6.5×108cfu·mL-1），37℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数及pH值。

1.2.5.2 最佳培养温度的确定

在筛选出的工业化培养基中接种1%的菌种，分别在37、39和42℃厌氧培养24 h，测定发酵液活菌数及pH值。

1.2.5.3 生长曲线的测定及pH变化

1%接种量接种于筛选出的工业化培养基中，37℃厌氧培养，分别于第0、3、6、9、12、15、21和24 h取样测定发酵液活菌数，以培养时间为横坐标，相应菌数的对数值为纵坐标，绘制生长曲线，同时测定培养基pH值。

2 结果与分析

2.1 双歧因子A含量对青春双歧杆菌影响

由图1可知，未添加双歧因子A的培养基中青春双歧杆菌活菌数小于107cfu·mL-1，pH 5.227。而添加不同浓度双歧因子A的培养基中青春双歧杆菌活菌数都大于108cfu·mL-1，pH差异不大（4.090～4.167）。可见双歧因子A的存在对青春双歧杆菌的生长有明显的促进作用。此外，当双歧因子A添加量为1%时，青春双歧杆菌活菌数最高为6.55×108cfu·mL-1。因此，选择双歧因子A添加量为1%。

图1 双歧因子A含量对青春双歧杆菌影响Fig.1 Effect of Bifidobacterium factor A on the growth of B.adolescentic

2.2 葡萄糖含量对青春双歧杆菌影响

由图2可知，添加不同含量的葡萄糖对青春双歧杆菌活菌数及pH没有明显的影响，这与文献报道添加葡萄糖对双歧杆菌生长有促进作用的结论不一致[13]，原因可能是由于当培养基中添加一定浓度双歧因子A后掩盖了葡萄糖对青春双歧杆菌生长的促进作用。从降低生产成本和提高青春双歧杆菌活菌数两方面综合考虑，选择葡萄糖添加量为0。

2.3 乳清粉含量对青春双歧杆菌影响

由图3可知，在含有8%脱脂乳、1%双歧因子A和1%双歧因子B的培养基中添加不同浓度的乳清粉对青春双歧杆菌生长没有明显的影响。从降低生产成本和提高青春双歧杆菌活菌数两方面综合考虑，选择乳清粉添加量为0。

图2 葡萄糖含量对青春双歧杆菌影响Fig.2 Effect of contents of glucose on B.adolescentic

图3 乳清粉含量对青春双歧杆菌影响Fig.3 Effect of contents of whey powder on B.adolescentic

2.4 双歧因子B对青春双歧杆菌影响

由图4可知，在添加不同浓度的双歧因子B的培养基中，青春双歧杆菌活菌数均大于108cfu·mL-1，pH无明显差异。此外，当双歧因子B添加量为1%时，青春双歧杆菌活菌数相对较高为4.4×108cfu·mL-1。因此，选择双歧因子B添加量为1%。

图4 双歧因子B含量对青春双歧杆菌影响Fig.4 Effect of Bifidobacterium factor B on B.adolescentic

2.5 脱脂乳含量对青春双歧杆菌影响

由图5可知，培养基中脱脂乳含量为4%时，青春双歧杆菌活菌数为6.6×107cfu·mL-1，而脱脂乳含量为6%以上时，青春双歧杆菌活菌数均为108cfu·mL-1以上；不同发酵液的pH差异不大。由此可以看出，培养基中含有1%双歧因子A和1%双歧因子B的同时，只有当脱脂乳含量在6%以上时才能保障青春双歧杆菌生长充足的氮源和碳源。脱脂乳含量为6%和8%的发酵液中青春双歧杆菌活菌数差异不大，由于脱脂乳含量为8%的发酵液状态明显优于6%的发酵液，因此，青春双歧杆菌工业化培养基选择脱脂乳含量为8%。

图5 脱脂乳含量对青春双歧杆菌影响Fig.5 Effect of contents of skim milk on B.adolescentic

2.6 最佳接种量的确定

由图6可知，接种量为1%、3%和5%（V/V）时，发酵液中青春双歧杆菌活菌数及pH基本一致，当接种量为7%时，发酵液中青春双歧杆菌活菌数有所下降。因此，选择最佳接种量为1%（6.5×106cfu·mL-1）。

图6 接种量对青春双歧杆菌影响Fig.6 Effect of inoculation amount on B.adolescentic

2.7 最佳培养温度的确定

由图7可知，发酵液中青春双歧杆菌活菌数随培养温度的升高而降低，青春双歧杆菌在37℃生长最旺盛，与先前的研究结论一致[8]，因此，选择37℃做为青春双歧杆菌的最佳培养温度。此外，由于青春双歧杆菌在39和42℃培养时活菌数也在可以接受的范围内（>108cfu·mL-1），因此，在特殊的生产工艺中也可将青春双歧杆菌的培养温度适度提高。

图7 培养温度对青春双歧杆菌影响Fig.7 Effect of temperature on B.adolescenti

2.8 青春双歧杆菌在工业化培养基中的生长特性

由图8可知，青春双歧杆菌在此培养基中的对数生长期为3～9 h，37℃厌氧培养9 h时，青春双歧杆菌活菌数达到最高1.16×109cfu·mL-1。

3 讨 论

双歧杆菌对营养要求苛刻，培养基中除了含有细菌生长所必需的碳源和氮源外，还必须含有丰富的氨基酸、维生素和糖类等物质。Chou等研究了长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌在添加酵母粉、蛋白胨等营养物质的豆乳中的生长特性[13]。杜鹏等研究了婴儿双歧杆菌在添加蛋白胨、酵母粉、胡萝卜汁和低聚糖等营养物质的发酵培养基的生长特性[10]。孟祥晨等采用正交试验优化了青春双歧杆菌基础培养基及增殖因子的用量，得到了青春双歧杆菌增菌培养基[8]。但上述培养基成分复杂、操作繁琐、成本较高不适宜大规模生产，此外双歧杆菌对氧气十分敏感，在培养以及保存时受到一定的限制。

本研究确定的青春双歧杆菌工业化培养基解决了青春双歧杆菌培养困难、生产成本高和不适合规模化生产的问题。有关菌液浓缩及冻干条件还需进一步考察，将菌液制成高活菌数的冻干菌粉，解决保存困难的问题。

4 结论

通过单因素试验确定青春双歧杆菌工业化培养基成分为：脱脂乳8%（W/V）、双歧因子A 1%（W/V）、双歧因子B 1%（W/V）。利用上述培养基，确定了青春双歧杆菌的最佳接种量为1%（V/V）、最佳培养温度为37℃。在此条件下，测定了青春双歧杆菌的生长曲线和pH值变化，在37℃厌氧条件下培养时间9 h为最佳生长条件，此时青春双歧杆菌活菌数最高可达1.16×109cfu·mL-1。双歧因子A的存在对青春双歧杆菌的生长有明显促进作用。

[1] Metal T.The effects of Bifidobacterium breve administration on campylobacter enteritis[J].Acta Paediatr,1987,29:160-167.

[2] Rial D R.The role of probiotic cultures in the control of gastrointestinal health[J].Nutrition,2000,130:396-402.

[3] Brady L J,Gallaher D D,Busta F F.The role of probiotic cultures in prevention of colon cancer[J].Nutrition,2000,130:410-414.

[4] Yusof R M,Haque F,Ismail M,et al.Isolation of Bifidobacteria infantis and its antagonistic activity against ETEC O157 and Salmonella typhimurium S-285 in weaning foods[J].Asia Pacific J Clin Nutr,2000,9(2):130-135.

[5] Gibson G R,Willems A,Reading S,et al.Fermentation of nondigestible oligosaccharide by human colonic bacteria[J].Proc Nutr Soc,1996,55:899-912.

[6] Arunachalam K D.Role of bifidobcteria in nutrition,medicine and technology[J].Nutr Res,1999,19(10):1559-1597.

[7] Annan N T,Borza A D,Hansen L T.Encapsulation in alginatecoated gelatin microspheres improves survival of the probiotic Bifidobacterium adolescentis 15703T during exposure to simulated gastro-intestinal conditions[J].Food Research International,2008,41:184-193.

[8] 孟祥晨,王亚峰,霍贵成.青春双歧杆菌增菌培养基的优化[J].食品与发酵工业,2002,28(7):15-19.

[9] 肖仔君,陈惠音,杨汝德.两歧双歧杆菌增殖培养基的优化[J].韶关学院学报:自然科学,2005,26(9):87-90.

[10] 杜鹏,罗薇,霍贵成.婴儿双歧杆菌发酵培养基组成的优化[J].食品科学,2004,8:91-94.

[11] Kaplan H,Hutkins R W.Fermentation of fructooligosaccharides by lactic acid bacteria and Bifidobacteria[J].Applied and Environmental Microbiology,2000,66(6):2682-2684.

[12] 田寒友,刘松,蒋菁莉,等.长双歧杆菌BBMN68工业化培养基筛选[J].乳品加工,2009(8):50-53.

[13] Chou C C,Hou J W.Growth of Bifidobacteria in soymilk and their survival in the fermented soymilk drink during storage[J].International Journal of Food Microbiology,2000,56:113-121.