原花青素脂质体的制备条件优化

胡 博，姚薇薇，刘 宁

（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

原花青素（Procyanidins，PC，曾用英文名Proanthocyanidins，Pycnogenol）是一大类多酚化合物的总称，由不同数目的黄烷-3-醇或黄烷-3，4-二醇聚合而成。按聚合度大小，二至四聚体称为低聚原花青素（Oligomeric proanthocyanidins，OPCs），五聚体以上称为多聚原花青素（Polymers procyanidins，PPCs）[1-2]。近代研究发现，原花青素具有极强的清除自由基能力和显著的抗高血压[3－4]、抗动脉粥样硬化、抗肿瘤防癌等生理功能，其清除自由基的能力是VC的20倍、VE的50倍[5－6]，以安全低毒、高效、高生物利用率而著称[7]，其在食品添加剂、保健品、药物和化妆品等领域得到了广泛的应用。由此可见，对原花青素进行研究，有利于更好地利用该宝贵资源。

原花青素的水溶性较好[8]，但稳定性较差，易受外界条件影响[9]，如易氧化，对光、热、pH值敏感等[10-11]，这使其应用受到限制。因此，必须对它进行保护。目前研究较多的是原花青素微胶囊，并且已经进行了工业化生产，但是其粒径较大，不利于人体吸收，如何在有效保护原花青素的同时减小其粒径一直是个难题。采用脂质体包埋可以解决这一难题[12]，脂质体粒径小，具有靶向性，有利于吸收，制备工艺简单，具有广泛的应用前景。制备脂质体的方法很多，其中逆相蒸发法制备的大单层脂质体具有较大的水性空间，更适合对水溶性物质的包埋[13]。任文霞等在进行茶多酚脂质体制备方法的筛选时，发现逆相蒸发法制备的茶多酚脂质体包埋率较高，可达48.9%[14]。周威比较了在相同条件下应用逆相蒸发法和其他方法制备了溶菌酶脂质体，经过研究他发现逆相蒸发法的包埋率最高，适用于工业生产[15]。

本试验以大豆卵磷脂、胆固醇为膜材，采用逆相蒸发法制备原花青素脂质体。以脂质体包埋的形式来增强原花青素的稳定性，通过试验研究，对原花青素脂质体的制备条件进行了优化。

1.3 方法

1 材料与方法

1.1 试剂

原花青素，纯度为95%（购自山东临沂泰豪国际贸易有限公司）；大豆卵磷脂（购自上海源聚生物科技有限公司）；胆固醇（购自天津市博迪化工有限公司）；无水乙醇、正丁醇、盐酸及其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

ZFQ85B旋转蒸发仪（购自上海医械专机厂）；KQ32000DB型数控超声波清洗器（购自上海昆山超声仪器有限公司）；SYNERGY超纯水仪（购自美国Millipore公司）；AL204精密电子天平（购自瑞士梅特勒-托利多公司）；UV-2401PC紫外可见分光光度计（购自日本岛津公司）；DelsaNano C型粒度分析仪（购自美国贝克曼库尔特有限公司），DelsaNano C型Zeta电位分析仪（购自美国贝克曼库尔特有限公司）；透射电子显微镜（购自日本日立H-7650）。

1.3.1 逆相蒸发法制备空白脂质体

取总量为0.4 g，一定比例的大豆卵磷脂、胆固醇置于梨形烧瓶中，加入体积比为1：1的乙醚和乙醇溶解，振摇，再加入一定浓度的2 mL磷酸缓冲液，震荡混合均匀，超声5 min，旋转至干成膜，加入磷酸缓冲溶液，使膜溶解并充分水合，将所得粗混悬液过0.45 μm滤膜，得到空白脂质体。

1.3.2 逆相蒸发法制备原花青素脂质体

取总量为0.4 g，一定比例的大豆卵磷脂、胆固醇置于梨形烧瓶中，加入体积比为1：1的乙醚和乙醇溶解，振摇，再加入一定浓度的2 mL磷酸缓冲原花青素溶液，震荡混合均匀，超声5 min，旋转至干成膜，加入磷酸缓冲溶液，使膜溶解并充分水合，将所得粗混悬液过0.45 μm滤膜，得到原花青素脂质体混悬液。

1.3.3 原花青素的测定

取不同浓度原花青素对照品的样液0.5 mL，加入到20 mL的具塞试管中，然后加入5 mL正丁醇-盐酸（体积比95：5）溶液，摇匀。打开塞子放入97℃恒温水浴中，3 min后塞紧塞子，加热40 min后，打开塞子，冷却5 min。于546 nm处测定吸光值，绘制标准曲线。

1.3.4 原花青素脂质体包埋率的测定

总原花青素含量：取等量原花青素脂质体和空白脂质体于试管中，加入适量无水乙醇破乳，15 000 r·min-1离心30 min，取上清液，定容至25 mL，以离心后的空白脂质体作对照，用正丁醇-盐酸法测定制备样品中总原花青素的含量。

游离的原花青素含量：吸取等量原花青素脂质体和空白脂质体于离心管中，15 000 r·min-1离心30 min，取上清液，定容至25 mL，以离心后的空白脂质体作对照，用正丁醇-盐酸法测定制备样品中游离原花青素的含量。

包埋率计算公式为：包埋率（%）=（添加原花青素总含量＋游离原花青素的量）/添加原花青素总量×100%

1.3.5 脂质体显微形态观察

将脂质体混悬液在透射电子显微镜下进行观察。透射电子显微镜采用磷钨酸负染法进行，即将脂质体稀释一定倍数后滴至专用铜网上，静止吸附3 min，用滤纸吸干铜筛边缘多余的液体样品，然后放在一滴用2.0%磷钨酸溶液上进行复染，用滤纸吸干铜筛边缘多余的染色液，自然晾干后放入透射电子显微镜下进行观察。

1.3.6 脂质体粒径的测定

依次取适量的脂质体混悬液，用DelsaNano C粒度分析仪测定原花青素脂质体的粒径。每个样品重复运行3次取平均值。

1.3.7 脂质体Zeta电位的测定

依次取适量的脂质体混悬液放入样品池中，用DelsaNano C电位仪测定脂质体的电位。每个样品测定3次取平均值。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

图1为原花青素不同浓度组成标准曲线。由图可知，在测定范围内，原花青素的浓度与吸光值有良好的线性关系，线性方程为y=1.4011x-0.0076，以此标准曲线计算原花青素脂质体的包埋率。

图1 原花青素浓度标准曲线Fig.1 Standard curve of procyanidine concentration

2.2 胆固醇与卵磷脂的不同比例对包埋率的影响

胆固醇与卵磷脂是脂质体形成不可缺少的膜材，二者比例是影响脂质体包埋率的主要因素。卵磷脂是脂质体的主要膜材，加入胆固醇可以改变其相变温度，对脂质膜的流动性产生双向调节功能。根据国内外已有文献及预实验结果，胆固醇与卵磷脂物质的量比在1：1～1：5包埋率较高。在一定的比例范围内，如果胆固醇的比例过大，组成脂质体的卵磷脂添加量太少，脂质体膜的形成就会困难，而且不牢固，而由此形成的脂质体膜亲水性太强，膜也容易破坏。固定其他组分的比例不变，仅改变胆固醇和卵磷脂的比例，制备原花青素脂质体，包埋率随两者比例的变化情况见图2。

图2 胆固醇与卵磷脂比对包埋率的影响Fig.2 Effect of the ratio of cholesterol to lecithin on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

由图2可知，随着卵磷脂的增加，原花青素脂质体的包埋率先增加后减小。当胆固醇与卵磷脂摩尔为1：2时，原花青素脂质体包埋率最高，为80.5%±3.4%。

2.3 原花青素添加量对包埋率的影响

水溶性药物被包埋于内核水相中，经常在脂质体水相和油相间重新分配，容易引起药物的泄露，所以原花青素的添加量直接影响脂质体的包埋率。选择原花青素与卵磷脂的不同比例，根据预实验当其比例在1：10～1：50时包埋率较高。固定其他组分的比例不变，只改变原花青素与卵磷脂的比例，制备原花青素脂质体，包埋率随两者比例的变化情况见图3。

图3 原花青素与卵磷脂比对包埋率的影响Fig.3 Effect of the ratio of procyanidine to lecithin on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

由图3可知，随着卵磷脂的增加，脂质体的包埋率升高，但药脂比大于1：40后，包埋率开始降低。当药脂比为1：40时，包埋率达到最高值。

2.4 水溶液与有机溶剂不同比例对包埋率的影响

通过逆相蒸发法可以得到大单层脂质体，脂质体有较大的水性空间，所以选择适当的水溶液与有机溶剂体积比可使内相体积增加，通常选择在1：2～1：6范围内。固定其他组分的比例不变，改变水溶液与有机溶剂比例，制备原花青素脂质体，包埋率随两者比例的变化情况见图4。

图4 水溶液与有机溶剂比对包埋率的影响Fig.4 Effect of the ratio of water to organic solvent on entrapment efficiency of procyanidine liposomes

由图4可知，当比例为1：3时，包埋率最高。在制备过程中，水溶液与有机溶剂的比例影响脂质材料的溶解度，从而影响脂质体的包埋率。

2.5 温度对包埋率的影响

制备过程中，水浴温度高时脂质的成膜速度快，卵磷脂和胆固醇间不易形成致密结合，且原花青素对热不稳定，因此成膜时水浴温度不宜超过50℃。制备原花青素脂质体，固定其他组分的比例不变，仅改变水浴的温度，包埋率随温度的变化情况见图5。

图5 温度对包埋率的影响Fig.5 Effect of the temperature on entrapment efficiency

在制备过程中，温度对包埋率有较大影响，温度过高时，脂质体流动性变大，膜内包封的物质易于泄露；而温度过低时，有机溶剂的挥发速度变慢，影响脂质体的形成。由图5可知，35℃时原花青素脂质体的包埋率最高，而50℃时的包埋率较45℃时高，原因可能是原花青素的热稳定性差，导致其热降解，故所得包埋率较高。

2.6 正交设计确定原花青素脂质体配方

根据初步试验分析，影响原花青素脂质体包埋率的主要因素有胆固醇与卵磷脂物质的量比、原花青素与卵磷脂质量比、水溶液与有机溶剂体积比、温度。因此用L9（34）正交试验设计法进行试验，确定原花青素脂质体的配方比例。

表1 正交试验设计Table 1 Orthogonal design

根据单因素试验结果，按照表1正交试验设计确定的配方，以原花青素的包埋率为指标，确定最佳配方，结果见表2。

由表2的K值分析可以看出，4个因素对包埋率的影响顺序为A＞B＞D＞C，即胆固醇与卵磷脂比＞原花青素与卵磷脂比＞温度＞水溶液与有机溶剂比。该正交实验的最优工艺条件为A2B2C3D2，但是此条件所得出的包埋率不如试验5的包埋率高。因此最佳工艺条件是A2B2C3D1，即胆固醇与卵磷脂的物质的量比为1：2，原花青素与卵磷脂的质量比为1：40，水溶液与有机溶剂比为1：4，温度为30℃，以此工艺条件制备三次原花青素脂质体，计算出包埋率的平均值为88.89%±2.5%。方差分析表明（见表3），在本试验所选取的因素和水平下，胆固醇与卵磷脂比对包埋率有显著影响，是影响脂质体包埋率最主要的因素。

表2 原花青素脂质体正交设计结果Table 2 Results of orthogonal design about procyanidine liposomes

表3 包埋率方差分析Table 3 Variance analysis for entrapment efficiency

2.7 脂质体显微形态观察

对脂质体进行负染色后，在透射电子显微镜下观察脂质体微观结构（见图6），呈球状或近似球状的小囊泡，分布均匀且颗粒间彼此分散。

图6 逆相蒸发法制备的原花青素脂质体的复染色电镜Fig.6 Electron microscope graph of procyanidine liposomes prepared by reverse evaporation

2.8 脂质体粒径的测定

经DelsaNano C粒度分析仪测定原花青素脂质体的粒径，脂质体的粒径分布在185 nm～1.29 μm之间，平均粒径为715.9 nm。

2.9 脂质体Zeta电位的测定

经DelsaNano C电位仪测定原花青素脂质体的Zeta电位。一般情况下，Zeta电位的绝对值越大，说明胶体体系越稳定，当电位＞60 mV时体系稳定，电位30～60 mV时体系比较稳定，电位＜30 mV时体系不稳定。因此，Zeta电位是衡量胶体稳定性的一个重要参数。测得的Zeta电位为37.04 mV，因此制备的原花青素脂质体混悬液是比较稳定的体系。

3 讨论与结论

本研究在单因素试验基础上，经正交设计试验分析得出最佳工艺组合为A2B2C3D2，各因素对包埋率的影响顺序为A＞B＞D＞C，即胆固醇与卵磷脂比＞原花青素与卵磷脂比＞温度＞水溶液与有机溶剂比，但在此条件下所得出的包埋率较A2B2C3D1所得到的结果低，分析其原因，可能是水浴温度高时脂质的成膜速度快，卵磷脂和胆固醇间不易形成致密结合，从而影响脂质体的包埋率。考虑到本试验的目的是制备包埋率高的原花青素脂质体，故确定处方工艺组合为A2B2C3D1，即胆固醇与卵磷脂的物质的量比为1：2、原花青素与卵磷脂的质量比为1：40、水溶液与有机溶剂比为1：4、温度为30℃。在此条件下，原花青素脂质体的包埋率为88.89%±2.5%。

脂质体的包埋体积和脂质体的粒径呈线性关系，主要取决于包埋的水相体积[16]。粒径越小包埋的水相体积越小，会降低脂质体的包埋率。本研究中制备的脂质体为大单室脂质体，其具有较大的水相容积，平均粒径为715.9 nm，包埋率较高。Zeta电位测定表明原花青素脂质体电位处于30～60 mV之间，是比较稳定的体系。此种制备方法操作方便、设备简单，适合工业化生产。

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