黑穗醋栗叶斑病病原鉴定

刘 彤，杨国慧，夏筱丽

（东北农业大学园艺学院，哈尔滨 150030）

黑穗醋栗属于茶藨子科（Grossulariaceae）茶藨子属（Ribes L.），是一种有特色的寒地小浆果类果树，在其生长过程中，易受到真菌病和多种病毒病的危害。在真菌病害中，白粉病、叶斑病和锈病是黑穗醋栗的主要病害[1-2]。近年来，叶斑病在黑龙江省和新疆黑穗醋栗栽植区的发生越来越普遍，而且逐渐加重，严重地影响了植株的营养生长和株丛产量。关于黑穗醋栗叶斑病，国外的研究报道认为引起叶斑病的病原主要有两种[2]：①褐斑病病原菌（Gloesporium ribis），属于半知菌亚门（Deuteromycetes）盘圆孢属（Gloesporium）；②白斑病病原菌（Septoria ribis），属于半知菌亚门（Deuteromycetes）壳针孢属（Septoria）。国内只是对其发病症状有过记载[3]，对病原的研究尚未见报道。本研究的主要目的就是通过在黑龙江省黑穗醋栗的主要栽植区采集病样，进行分离、纯化和鉴定叶斑病的病原菌，以期为生产上防治该病害及黑穗醋栗的抗叶斑病育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

病样分别采自于黑龙江省海林市、桦川县、宾县和东北农业大学园艺实验站。

1.2 病原菌的分离、纯化及初步鉴定

田间采集典型发病的病叶，制成临时切片，于显微镜下观察分生孢子器及分生孢子的形态；同时用清水将病叶冲洗干净，采用组织分离法对病斑进行分离，直到获得纯化的病原菌，观察并记载病原菌的菌落特征。挑取少量纯化后的菌丝及孢子，于显微镜下观察形态，根据有关资料进行病原菌所属种的鉴定[4]。

挑取部分纯化后菌丝转到斜面马铃薯胡萝卜琼脂培养基（Potato carrot agar，PCA）上，冰箱冷鲜层中保存，备用。

1.3 病原菌适宜培养基的筛选

选择在PDA上生长良好的菌落，在菌落边缘用无菌的打孔器打成直径6 mm菌饼，分别置于4种平板培养基：PDA、玉米粉琼脂培养基、燕麦片培养基和含有黑穗醋栗叶片汁液培养基上培养，重复3次。其中前3种培养基的配制方法参见文献[4]。含有黑穗醋栗叶片汁液培养基的配制为：鲜叶片100 g（磨成汁液），葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL。每隔1 d十字交叉法测量菌落直径，第6天到第12天，每隔1 d采用血球计数板法测产孢量。

1.4 接种及病原菌的再分离、鉴定

根据柯赫法则进行病原物的接种。取自然产孢较好的菌落，刮下表面产生的大量分生孢子，用无菌水稀释离心后制成孢子悬浮液（1×106个·mL-1）。分别接种在4～5叶期的黑穗醋栗苗上和离体叶片上。接种方法：①喷雾接种：用小型喷雾器将孢子悬浮液直接喷到苗期叶片上；②摩擦接种：叶片用细目金刚砂摩擦后用棉花蘸取孢子悬浮液涂抹；③菌饼接种，用打孔器打成直径6 mm菌饼，菌面朝下反接在苗期叶片上。

按照上述方法接种后置于人工气候培养箱中，套袋保湿24 h，接种期间环境条件为光照条件28℃、14 h，无光条件20℃、10 h，以喷清水为对照，逐日观察并记录。对接种后发病的叶片进行病原菌的再分离和鉴定，方法同1.2。

2 结果与分析

2.1 黑穗醋栗叶斑病田间表现

发病初期为6月下旬，盛期为7月中下旬。病害传播非常快，4～6 d即可全园不同程度感病。田间表现为：最初在下层叶片上形成浅褐色水渍状小斑点，组织变薄（对着光线看半透明）。病害迅速向上发展，形成圆形或有棱角的褐色斑点。病斑边缘呈深褐色，内部较浅，直径1～5 mm。后期病斑转为浅灰色或灰白色，中间出现小的黑色小球状（球似体）分生孢子器。严重时多个病斑汇合成片，形成不规则的大片枯斑，导致叶片失绿、卷曲，提前脱落（见图1）。

图1 病害田间症状Fig.1 Symptom of blackcurrant leaf spot in field

2.2 叶斑病病原菌的分离、纯化和初步鉴定

研究结果表明，在PDA上，菌落圆形，培养初期气生菌丝白色，平铺呈绒毛状，边缘光滑。菌落生长较快，后期菌落呈土黄色，从中心向外缘逐渐变淡，有蘑菇的气味；菌丝体呈树杈状伸展，白色，有隔膜；分生孢子器球形或近球形，器壁暗褐色，膜质（见图2）；分生孢子线形，无色透明，正直或弯曲，基部近截形，顶端略尖，1～3个隔膜，大小为（35～50）μm×（1.5～2.5）μm（见图 3）。根据以上特征并参考文献[5-6]，确定分离的病原菌为壳针孢属（Septoria），属于半知菌亚门（Deuteromycetes）球壳孢目（Sphaeropsidales）球壳孢科（Sphaeropsidaceae）。

图 2 分生孢子器（×400）Fig.2 Pycnidium of Septoria sp.from blackcurrant

图3 分生孢子（×400）Fig.3 Conidia of Septoria sp.from blackcurrant

2.3 不同培养基对菌丝生长及产孢量的影响

病原菌在4种培养基上均可生长，其中在PDA上生长最好，颜色均匀、菌丝紧密，产孢量好，培养6 d菌落直径达90.0 mm，12 d产孢量达到8.55×106个·mL-1。燕麦片培养基和玉米粉琼脂培养基次之，菌落直径和产孢量分别为88.3 mm，4.40×106个·mL-1和 81.8 mm，3.80×106个·mL-1。病原菌在含有黑穗醋栗汁液的培养基上生长较弱，6 d菌落直径仅为55.0 mm，并且不产生孢子（见表 1）。

2.4 病原菌的接种、再分离与鉴定

人工气候培养箱内的接种试验结果表明，利用4～5片叶的黑穗醋栗苗为接种材料，采用摩擦接种1个多月左右，叶片正面出现黄绿色近圆形的斑点，半透明，稍后斑点变褐，症状与田间观察到的初期症状一致，而其他方法均未表现出症状。对接种后的发病叶片镜检观察发现无色透明的线形孢子，符合柯赫定律，由此再次证明引起黑穗醋栗叶斑病的病原菌为壳针孢属（Septoria）真菌。

表1 不同培养基对菌丝生长及产孢量的影响Table 1 Effect of different medium on pathogen growth and number of sporification

3 讨论

白俄罗斯的研究结果认为，黑穗醋栗叶斑病主要有两种：①褐斑病：主要症状为在叶片形成小的、不清晰的、不规则的黑褐色斑点，发病严重时斑点连接起来，叶片变褐、干枯、边缘向上卷曲。引起褐斑病的病原菌属于半知菌亚门（Deuteromycetes）盘圆孢属（Gloesporium），其有性阶段为子囊菌亚门（Ascomycetes）假盘孢属（Pseadopeziza）；②白斑病：主要症状为在叶片上形成多数的浅灰色带有褐色边缘的圆形或角形斑点，在斑点上形成黑色的小球状分生孢子器。引起白斑病的病原菌属于半知菌亚门（Deuteromycetes）壳针孢属（Septoria），其有性阶段为子囊菌亚门（Ascomycetes）球腔菌属（Mycosphaerella）。其研究结果表明，上述两种病原菌有性孢子形成的高峰期在冬春冻融交替季节。褐斑病菌只侵染叶片，而白斑病菌除侵染叶片外，还侵染叶柄、果实和幼枝[2]。本研究在采集病样时也观察到了上述两种症状，但是在采集的病样中只鉴定出了壳针孢属（Septoria）真菌。此外通过对病样连续取样观察（一直到冬春冻融交替季节，冬季取田间落叶），尚未观察到病原菌的有性阶段以及白斑病病原菌侵染叶柄、果实和幼枝，分析原因可能是不同的品种、不同的气候条件导致病原菌的种类、病害的发展规律有所不同，同时也说明今后还应持续开展黑穗醋栗叶斑病的研究工作，特别是要加强对病害发生规律的研究。

目前国外对黑穗醋栗叶斑病的防治除了加强果园管理，如清扫病叶、合理施肥外，主要是采用药剂防治。药剂的防治主要在以下三个时期进行：有性孢子散发期、无性孢子散发期和果实采收后，而且强调生物药剂的使用[2]。选育抗病品种是预防病害最切实有效的途径，但目前国外对选育抗性品种的报道不多，而且被鉴定的材料高抗褐斑病和白斑病的品种很少[7-13]。为了选育抗病品种，今后的工作应广泛收集黑穗醋栗种质资源并进行抗性鉴定，为此还必须建立快速有效的人工接种方法。Лозовская对接种方法进行了研究，认为摩擦接种的效果好于不摩擦接种，而且只摩擦叶柄洼处的接种效果要好于整个叶片摩擦接种[2]。本研究对接种方法也进行了初步摸索，从研究结果看也是采用摩擦接种效果较好，但还存在发病时间长、效果不是特别明显的问题，可能是由于人工气候箱内的条件和自然条件有差异的缘故，另外也进行了只摩擦叶柄洼处的接种试验，但是植株没有发病，所以今后还应进行快速接种方法的筛选工作。此外，在选育抗源材料时除对现有的品种、品系筛选外，也要从我国丰富的茶藨子属（Ribes L.）野生资源中筛选。

4 结论

本研究得出如下结论：在黑龙江省引起黑穗醋栗叶斑病的病原为壳针孢属（Septoria）真菌，适于该病原菌生长的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

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