中西药复方制剂"复方龙胆散"防治青蛙肝炎和腹水症的研究

王康文

（海南省屯昌县畜牧兽医局，屯昌 571600）

泰国虎纹蛙，原产于泰国，是继美国青蛙之后引进的又一新的食用蛙品种，又名泰国青蛙，俗称泥蛙、田鸡、田蛙、水鸡等，属两栖纲、无尾目、蛙科[1]。海南自1997年从泰国引种虎纹蛙以来，虎纹蛙的人工养殖迅速发展，现在已成为一个较大的产业。不过，随着海南虎纹蛙养殖不断发展，相关病害也越来越多，其中，由嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌引起的肝炎和腹水症病症尤为严重。该蛙病呈爆发性，来势迅猛，正常进食的病蛙，一旦出现少数蛙死之后，在短短几天内，全池蛙死亡率可达60%以上，是一种恶性传染病，危害极大，给养殖户造成了很大的经济损失。由于从不同水体或同一水体不同时间分离到的病原菌对药物敏感性有一定差异，治疗难度较大。为了探讨防治肝炎和腹水症合适药物，我们根据药敏实验筛选了系列对该病的病原有效治疗的药物，并对有关防治方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材料的来源

1.1.1 患病虎纹蛙

由海南文昌市大致坡镇、琼海市长坡镇、湖南等蛙场提供的患有腹水和肝炎症的病蛙一批。

1.1.2 实验设备

解剖剪刀、酒精灯、固定木板、铁钉、手套、接种玻璃棒、接种铁丝、平板、培养基等。

1.1.3 培养基制备

先将高压灭菌过的空烧瓶中加入所要配制总量的50%左右的水，分别称取牛肉膏3g、蛋白胨5g、琼脂粉7g、酵母浸膏1g，然后用玻璃棒搅匀，再加热溶解，定容。用1/10的NaOH调PH，用PH纸对照PH值为7.2，培养基即可使用，待降温后放入冰箱低温保存待用。

1.1.4 中西药复方制剂

以龙胆、黄芩、甘草、柴胡等中药材，并辅以抗菌药物诺氟沙星和抗应激剂维生素C等为基础组方的护肝方剂“复方龙胆散”。用于保肝、护肝、杀菌和防治肝炎和腹水症疾病。精选以上中药材料经粉碎，过80目筛，加入诺氟沙星等复配制备。

1.1.5 标准药敏纸片

北京天坛药物生技术开发公司生产，批号为20060203。

1.2 实验方法

1.2.1 病原的接种培养[2]

（1）腹水症的病原接种 把培养基等所用器材准备好，将蛙固定在木板上，用剪刀将病蛙腹部皮肤剪开（在每次使用剪刀或者其他金属器材前都将之放在火焰上微烧消毒），用接种铁丝轻沾腹部流出的液体然后轻轻地涂在培养基表面上，做好记录放入恒温箱中恒温（37.5℃）24小时后观察病菌生长情况。（2）肝炎病原的接种培养 用剪刀把腹部皮肤完全剪开，用小剪刀把肝剪开一个小口，将接种铁丝插入剪开的小口中，沾住肝中的黏液涂在培养基上并作好记号，放入恒箱培养24小时后观察。

1.2.2 药敏试验

1.2.2.1 抗菌素纸片的制备

（1）将质量较好的滤纸用打孔机打成直径60mm的圆片，每100片放入一瓶中，高压灭菌（1.02kg30min）后在60摄氏度条件下烘干。

（2）用无菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml，加入100片纸片中，置冰箱内浸泡1-2h，立即试验可不烘干，若保存备用可用下列方法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存6个月）①培养烘干法：将浸泡有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于37℃箱内保持2-3h即可干燥，或放在无菌室内过夜干燥。②真空抽干法：将放有抗菌药物纸片的试管，置于燥管内，用真空抽气机抽干。将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中，置冰箱内保存备用。并用标准敏感菌株作敏感性试验，记录抑菌圈的直径，若抑菌圈的的比标准敏感菌株的原来缩小，则表该抗菌药物已失效，不能再用。

1.2.2.2 药敏试验操作

（1）用培养16-24h血平板上的菌落接种于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准。

（2）用无菌棉拭子蘸取少量的菌液，在M-H琼脂表面均匀涂抹接种3次，每次旋转平板60度，最好沿平板内缘涂抹一周。

（3）将接种的平板置室温下干燥3-5分钟后，用无菌镊子取含药纸片紧贴于琼脂表面，纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm，置35摄氏度培养16-18h后观察结果。

（4）24小时后取出所接种的病原观察，在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈一般抑菌圈是接近圆形的，抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最小抑菌浓度（minimal inhibitory，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大MIC愈小。

2 虎纹蛙肝炎和腹水症的病原及发病流行特点

2.1 虎纹蛙肝炎 是由于感染嗜水气单胞菌发病，不同规格的蛙均可发生，其特点是发病快，传染性强，死亡率高，危害大。一般发生在春末、初夏和秋末，水温15-30℃。该病主要症状是：病蛙外观呈肥胖感，双腿粗大，呈极淡红色，手压则有硬肌肉感，幼蛙皮肤在不同部位有溃疡缺损，形状不规则，若气温较低，溃疡处加大，甚至有肌肉腐烂状。有的个体前后肢均有淡红色出血感，解剖内脏发现，该病主要的病变在肝脏。肝异常肿大，可达正常肝的2倍左右，呈灰白色，胆肿大呈浅绿色，胃肠表面血管部分或全部充血，胃肠壁表面部分或全部充血发红，胃肠内有或无食物，具淡黄色黏膜。

2.2 虎纹蛙腹水症 是由于感染迟钝爱德华氏菌发病。症状：蛙传染性肝病，简称“肝病”，也有的称为大肚子病、鼓胀病、水肿病。发病时，病蛙精神不振，不摄食物，腹部膨胀、肿气，后肢股部皮肤大块状充血，有的腹部两前肢间出血，有数个小的血疙瘩，有的外表完好，不呈现任何特别明显的伤口；有腹水，肝肿大，有的充血，有的有白色点状坏死灶。胃壁树枝状充血，肠道充血，脾肿大，暗红。发病蛙数日若得不到及时治疗，将很快死亡。

2.3 危害程度：不论幼蛙或成蛙均可发生传染性肝炎和腹水症，嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌两种病原同时感染发病，前期肝炎为主，后期腹水严重，难于治疗，死亡率高达60%左右，且传染性很强，一个养殖池中有蛙发病，若不及时捞出，采取积极措施，往往导致整池蛙都发病。

3 结果与讨论

3.1 结果 观察的结果如下表1、表2所示，抑菌圈用直径/mm，敏感性用“-”“+”符号表示

表1 不同药物对虎纹蛙腹水症病原的抗菌活性

表2 不同药物对虎纹蛙肝炎病原的抗菌活性

3.2 讨论

3.2.1 虎纹蛙肝炎的剖检与药敏

从疑似病蛙解剖看到，虎纹蛙肝炎外观症状不明显，一旦发病，四肢无力，肌肉瘫软如一团稀泥，口腔有含血丝黏液吐出，并常伴有舌头从口腔中吐出的现象。肝脏严重变色，或失色呈灰白色或土黄色，胆囊也肿大呈现浅绿色，胃肠充血明显。肾脏有时也充充血肿胀。从发病到死亡一般为2～3天。死亡率极高。幼蛙发病后体表有不规则的溃疡斑，四肢及腹部皮肤充血呈深红色，肌肉呈现淡黄绿色。肝脏异常肿大，肝脏颜色呈灰白色，或严重充血呈墨绿色。胆汁浓，墨绿色。肠胃内无食物，时有肠段套进胃[3]。通过药物抗菌活性研究，阿米卡星，头孢曲松钠，氯霉素和“复方龙胆散”呈高度敏感（+++）；万古霉素呈中度敏感（+++），其他药物均低敏感或无敏感。

3.2.2 虎纹蛙腹水症的剖检与药敏

从疑似病蛙解剖看到，症状表现为腹水明显，腹部表面似有透明斑或斑点状出血；眼球时有充血，腹水也是困扰人工养殖户的一个重大问题之一 [4]，治疗过程长，而腹水难于消除，死亡率也很高，更主要的是蛙的耐药性越来越强，通过实验分析，阿米卡星，头孢曲松钠、“复方龙胆散”呈高敏（+++）头孢拉定呈中度敏感（++）；其他药物低敏感或无敏感。

3.2.3 临床治疗结果

从蛙汤送来疑似病蛙，经剖解初步判断为肝炎和腹水症，选用“复方龙胆散”进行混料投服，2次/日，用药三天能控制病情，5-7天基本治愈或转好。用中西药复方制剂进行治疗疑似病蛙11例，其中用8例治愈，2例好转，1例没有效果。

3.2.4 虎纹蛙肝炎和腹水症的防治措施

肝炎和腹水症由于其主要病变在肝、肾脏，中、后期病蛙造成水肿、腹水严重，治疗难度大，应以预防及早期治疗为主。

预防措施[5]：

（1）不喂变质的饲料，控制饲料中蛋白质含量，避免蛙体氨中毒，而造成肝肾的损害。（2）不长期过量使用磺胺、红霉素、链霉素等类药物，影响肝、肾代谢功能。（3）定期在饲料中添加护肝类中药制剂，柠檬酸钠制剂消除肾肿，保护肝肾功能。（4）控制水质，定期消毒。

治疗措施：[6]

该病的治疗以内服药和外用药联合使用效果最好。

外用药：选用溴氯海因，聚维酮碘溶液、葵甲溴铵溶液任一种进行全池遍洒或沿食台进行区域泼洒。

口服药：选用“复方龙胆散”进行混料投服，2次/日，连用5天。

本研究表明，抗菌药物阿米卡星、头孢曲松钠、氯霉素、诺氟沙星和“复方龙胆散”对嗜水气单胞菌呈高度敏感（+++），均可用于防治蛙的肝炎和腹水症，但由于阿米卡星、头孢曲松钠、氯霉素在水产动物中禁用，“复方龙胆散”既具有高敏的抗菌活性，而又能保肝、护肝，利于后期的恢复治疗。经临床试验，疗效确实。故可推荐中西药复方制剂“复方龙胆散”做为最佳选择药物。

[1]叶雪平.病蛙的诊断与防治技术（四）[J].水产科技情报，1999，26（4）：183-184。

[2]中国科学院微生物研究所细菌分类组。一般细菌常用鉴定方法[M]，北京：科学出版社，1978。

[3]贺路，艾晓辉，左文功.牛蛙腹水病病原研究[J]淡水渔业，1995，（03）

[4]葛艳，陈怀青，陆承平.迟缓爱德华氏菌胞外产物的细胞毒性和动物致病性[J].中国兽医学报，2000，（01）。

[5]李义.名特水产动物疾病诊治[M].北京：中国农业出版社，1999。

[6]阮新艳，阮洪，阮敏.虎纹蛙生态养殖技术的初步研究[J]福建水产，1994（1）：24-28。