不同基因型新城疫病毒对美国白羽王鸽的致病性研究

吴 双，王伟伟，曹军平，胡顺林，王晓泉，刘秀梵

(扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，扬州225009)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)属于副粘病毒科，禽腮腺炎病毒属。NDV为单股负链不分节段RNA病毒，主要编码6种病毒蛋白，基因组长约15 kb。新城疫(ND)是危害养禽业的重要传染病之一，给许多国家的养禽业造成巨大经济损失[1]。尽管NDV只有1个血清型，但不同基因型毒株之间的生物学特性存在明显差异。根据致病力的不同，NDV通常分为强毒株、中等毒力株和弱毒株。鸽新城疫是由鸽Ⅰ型副粘病毒(Pigeon paramyxovirus type 1，PPMV-1)引起的一种高度接触性传染病，是严重危害养鸽业的主要疫病之一[2]。多数学者认为，PPMV-1是鸡NDV的一种变异株[3]，值得注意的是大部分鸽源病毒株F蛋白裂解位点序列虽然为强毒特征，但它们对鸡的致病力却不强，主要呈中等毒力[4]。

研究表明，鸽群中所分离的NDV绝大多数属于基因Ⅵb型，与当前世界上流行的优势基因型并不一致，表明Ⅵb型NDV对鸽具有明显的宿主适应性。但迄今为止，Ⅵb亚型与其它基因型NDV对鸽的致病性尚无详尽报道。为了比较不同基因型NDV对鸽的致病性差异，本研究选择了4个不同基因的NDV强毒株，分别进行鸽的人工感染试验，并对接种后鸽的临床症状、病理变化、排毒规律、抗体变化及组织嗜性差异进行了研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株和实验动物 基因Ⅲ型鸡源NDV分离株JS-7-05-Ch、Ⅵ型鸽源NDV分离株WX-10-07-Pi和Ⅶ型鹅源NDV分离株JS-5-05-Go均为本实验室近期分离，经鸡胚成纤维细胞(CEF)噬斑纯化3次后SPF胚传代3次[5]；基因Ⅸ型病毒株F48E8由本实验室保存。SPF鸡胚购自山东家禽研究所。2月龄美国白羽王鸽购自江都飞亚肉鸽养殖基地。实验前血清检测证明，所有实验鸽均无NDV和禽流感病毒抗体。

1.2 主要仪器和试剂 7300型实时荧光定量PCR扩增仪，TaqMan Universal PCR Master Mix Kit为ABI公司产品；TRIzol抽提试剂购自Invitrogen公司；M-MLV反转录酶和RNasin购自Promega公司。

1.3 病毒毒力及ELD50测定 1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)，6周龄鸡静脉接种致病指数试验(IVPI)和最低致死量致死鸡胚的平均死亡时间(MDT)按照文献标准进行[6]。用Reed-Muench法计算鸡胚半数致死量(ELD50)。

1.4 鸽致病力试验 将2月龄美国白羽王鸽分组，每组10只，另取5只作为阴性对照组，隔离饲养。每只试验组鸽滴鼻、点眼接种106个ELD50的病毒剂量。将F48E8感染组作为阳性对照，阴性对照组鸽接种同体积的PBS。接种后观察30 d，记录实验鸽的临床症状及发病死亡情况；并定时采集泄殖腔棉拭子。

1.5 血清抗体的测定 于接种后第7 d、14 d和21 d采血，血清于-20℃保存，统一用1%健康鸡红细胞，以4个血凝单位LaSota病毒为抗原，采用β微量法测定HI滴度。

1.6 实时RT-PCR(RRT-PCR)检测组织中病毒的分布

1.6.1 引物设计 根据文献[7]合成NDV的1对特异引物及相应的探针。扩增片段位于M基因的保守区。引物由上海生工生物工程有限公司合成，探针由TaKaRa公司合成。预期扩增的片段为146 bp。上游引物：5'-AGTGATGTGCTCGGACCTTC-3'，下游引物：5'-CCTGAGGAGAGGCATTTGCTA-3'；探针：5'-[FAM]TTCTCTAGCAGTGGGACAGCCTGC[TAM RA]-3'。

1.6.2 组织样品处理 于接种后第4 d、7 d和14 d分别随机取两只鸽子(对照组取1只，濒死鸽随时解剖，存活鸽于第30 d解剖)进行病理解剖，记录剖检变化情况。采集气管、肾脏、脾脏、肺脏、肝脏、胰腺、十二指肠以及胸腺8种组织。按1 g组织样品加3 mL预冷PBS进行研磨，反复冻融3次后取上清，每份取250 μL上清用于RNA的提取。

1.6.3 RRT-PCR检测 按TRIzol法提取8种组织样品总RNA，以6碱基随机引物逆转录合成cDNA进行RRT-PCR检测。其反应体积为50 μL。并设阳性对照、阴性对照和定量标准品孔。反应程序为：95℃ 15 min；94℃10 s、52℃ 30 s、72℃ 10 s，共40个循环。荧光信号的收集及数据的采集定在52℃。检测结束，根据噪音情况设定和调整基线及阈值，根据荧光曲线和Ct值判断结果。

2 结 果

2.1 4株NDV的致病性 4株病毒的部分生物学特性进行测定结果见表1，综合MDT，ICPI和IVPI实验数据显示，JS-5-05-Go、JS-7-05-Ch和F48E8为强毒株，WX-10-07-Pi为中等毒力株。

2.2 临床症状和剖解病变

2.2.1 实验鸽发病及死亡情况 接种后48 h左右，JS-5-05-Go和F48E8试验组的鸽表现出明显的临床症状；接种后72 h，WX-10-07-Pi和JS-7-05-Ch仅表现出轻微的精神状态不佳。病鸽的临床表现主要有：体温升高；发病初期粪便呈黄白色或黄绿色或水样稀粪，后期为墨绿色粘性稀粪，耐过的病鸽粪便性状逐渐正常；眼睑发炎、眼睛半睁半闭，呼吸困难、咳嗽；大部分病鸽表现出翅膀悬垂或向两侧分开，两脚麻痹、呈劈叉姿势，并伴有阵发性痉挛瘫痪、转圈或震颤等神经症状。只有JS-5-05-Go和F48E8试验组的鸽出现死亡，死亡高峰期集中在接种后5 d～9 d。在1个月的实验期内，试验组鸽发病率为100%；除去剖解的病鸽外，F48E8和JS-5-05-Go试验组的死亡率分别为50%和100%，WX-10-07-Pi和JS-7-05-Ch组未见死亡。所有耐过的病鸽精神尚好，但明显消瘦。阴性对照组鸽未表现出异常症状。

表1 4个病毒生物学特性及其登录号Table 1 Biological characteristics and accession numbers of four isolates

2.2.2 病理解剖学变化 死亡鸽子脾脏肿大、颜色呈黑铜色、表面有针尖至粟粒大的灰白色的坏死结节或伴有出血点，肝脏呈土黄色，边缘、表面及心叶有出血点和出血纹，胰脏肿大、有出血点，部分胸腺肿大、充血，鼻腔、喉头和气管内存有浆液性渗出物，气管和喉头充血、出血，小肠和直肠有弥漫性出血点。

2.3 泄殖腔排毒检测 每个泄殖腔棉拭子接种3个9日龄～10日龄非免疫鸡胚，接种鸡胚的死亡时间在36 h～96 h之间。JS-7-05-Ch和F48E8接种组仅有个别棉拭子检测到病毒，JS-5-05-Go和WX-10-07-Pi接种组的棉拭子中病毒分离率较高，实验结果见表2。

表2 JS-5-05-Go和WX-10-07-Pi接种后泄殖腔棉拭子分离病毒结果Table 2 Isolation for viruses from cloacal swabs in pigeons after inoculation with JS-5-05-Go and WX-10-07-Pi

2.4 抗体变化 4株病毒感染鸽后分别于第7 d、14 d和21 d翅静脉采血，分离血清进行HI试验，结果见表3。阴性对照组的HI结果为0。

2.5 RRT-PCR技术检测各组织脏器中病毒的分布检测结果表明，脾脏、胸腺和肺脏中病毒的检出率较高；其余组织检出率较低，其中，胰腺中病毒的检出率最低；JS-5-05-Go实验组的检出率最高，WX-10-07-Pi组和F48E8组检出率相当，JS-7-05-Ch组检出率最低。本实验中，呼吸系统的检出率高于消化系统，特别是滴鼻和点眼接种似乎偏重于呼吸道症状，与文献报道的一致[8]。各组织脏器中病毒检出结果见表4。

表3 NDV接种后血清中平均抗体效价检测Table 3 Titeration of HI titers in pig serum after inolulation with viruses

表4 NDV在不同组织中检出率Table 4 The detection of NDV distribution among tissues

3 讨 论

目前NDV对鸽的致病性的研究仅限于临床症状、泄殖腔排毒和抗体变化，很少涉及到组织学病理变化以及病毒在组织器官中的分布等方面，研究不同基因型(中等毒力和强毒株)NDV同时感染鸽的实验研究数据目前还比较缺乏。

本实验中，鸡源JS-7-05-Ch、鸽源WX-10-07-Pi、鹅源JS-5-05-Go和鸡源F48E8(基因型分别为Ⅲ、Ⅵb、Ⅶd和Ⅸ)感染美国白羽王鸽，仅JS-5-05-Go和F48E8能够引起感染鸽的死亡。剖检病理变化主要出现在脾脏、肝脏、肠和胰腺等器官，但其出现比例和严重程度都不很高，有个别病鸽虽然临诊症状相当严重，剖检病变却并不显著，与文献报道一致[9]。

RRT-PCR检测结果表明虽然不同基因型的NDV都能在鸽体内进行复制，但各NDV对鸽组织脏器的亲嗜性强弱有一定的差别。WX-10-07-Pi、JS-5-05-Go和F48E8组的胸腺、脾脏和肾脏的病毒检出率相当；WX-10-07-Pi组的肺脏中病毒检出率明显高于其他3组，表明WX-10-07-Pi对鸽的呼吸道亲嗜性可能最强。

在发病初期，尽管4个基因型NDV感染鸽的临床症状相似，但是只有基因Ⅶd亚型和基因Ⅵb亚型毒株导致鸽泄殖腔出现排毒。实验结果表明，尽管F48E8对鸽的致病性明显强于Ⅵb亚型毒株WX-10-07-Pi，但感染鸽泄殖腔却极少检测到排毒，一定程度上表明，古老的基因型(Ⅲ和Ⅸ)NDV不易在鸽群中传播。与JS-5-05-Go(Ⅶd)相比，WX-10-07-Pi(Ⅵb)感染组鸽的泄殖腔棉拭子在感染后第5 d至15 d内均可检测到排毒，而且排毒率明显高于JS-5-05-Go感染组。结果表明，鸽源毒株WX-10-07-Pi感染鸽后，其在体内的带毒时间长且排毒率明显高于其它基因型NDV感染组。由于感染基因Ⅵ型NDV的鸽的临床症状很轻，这些患病鸽生活习性改变不大；而感染基因Ⅶ型NDV的鸽的临床症状相当严重，死亡率可达100%，限制了鸽的活动。同时，基因Ⅵ型NDV感染鸽的泄殖腔排毒时间长、泄殖腔的病毒检出率高。从临床症状、泄殖腔的排毒时间以及泄殖腔的病毒检出率可以部分解释基因Ⅵb亚型NDV比基因Ⅶd型NDV更易在鸽群传播。这些结果一定程度上验证了目前在我国Ⅵb亚型是鸽群中所特有的基因型，鸽源NDV分离株绝大多数属于该亚型。值得注意的是，虽然基因Ⅶd型毒株JS-5-05-Go首次在鸽体内进行实验，但是接种后也能在泄殖腔中排毒，而且感染鸽的发病程度与死亡率明显高于Ⅵb亚型毒株WX-10-07-Pi，因此，鸽群感染Ⅶd亚型并造成发病和流行的风险依然存在。

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