假型病毒制备与应用进展

张振杰，崔丽娜，张元鹏，赵 协，王 亮，常维山

(山东农业大学动物科技学院，山东 泰安 271018)

假型病毒(Pseudotyped virus)是利用现代生物技术人工合成的一种病毒，它与真病毒相比不仅囊膜上具有其他病毒的糖蛋白，而且核酸分子上编码囊膜蛋白的基因被删除，所以这种病毒只能进行“一个细胞周期”的侵染，在慢病毒表达高度发展基础上[1]，确保了假型病毒的生物安全性。一般在研究传染性强和不易体外培养的病毒囊膜蛋白的功能和性质时，制备假型病毒是一种行之有效的方法。假型病毒可以模拟真病毒的侵染，它的应用一定程度上避免了高致病性病毒的传播和扩散，在病毒学研究方面显示出许多优势。另外，具有复制功能和非竞争性的假型病毒载体能够在体外高效地转移靶基因于哺乳动物细胞，并且假型病毒宿主范围广、转染效率高、滴度高[2]、不易被血清补体灭活。因此假型病毒不仅可以用来研究病毒与宿主细胞的相互作用，鉴定病毒受体，更重要的是可以用于筛选抗病毒药物、测定患者体内中和抗体的效价、评价疫苗临床免疫的效果和作为基因治疗工具。

1 假型病毒的制备

1.1 假型病毒载体的特点 假型病毒的核酸骨架大多是经过基因修饰的逆转录病毒核衣壳基因，如艾滋病病毒、小鼠白血病病毒等。将基因组中的顺式调节元件(ψ包装信号，LTR长末端重复序列)和编码env囊膜蛋白的基因进行调整和分离，构建的载体具有最小辅助包装元件特点，去除了基因结构中不同辅助元件或用其它特异序列代替，敲除对病毒体外复制不重要但具有致病性的基因(如nef，vif，vpr等)，减少了病毒的序列数量。基因组3'LTR的U3区的一部分被删除，这一部分区域包含了TATA框，以及一些转录因子结合部位。在病毒RNA进行反转录的时候，删除了U3区的3'LTR成为了5'LTR，由于其缺少了增强子以及转录因子结合部位，导致了病毒RNA不能转录，降低同源重组的风险，因此该系统更加安全。目前新一代慢病毒载体例如人获得性免疫缺陷病毒/水泡性口炎病毒(HIV/VSV)假型病毒系统在前四代慢病毒载体基础上增加了两个基因元件旱獭转录后调控元件(WPRE)和聚嘌呤区(CPPT)。WPRE来自旱獭肝炎，与目的基因片段的下游区相连接，提高目的基因表达量[3]。CPPT来自HIV-I剪切酶基因，能够增加插入靶细胞染色体的慢病毒拷贝数[4]，并且提高病毒滴度。WPRE和CPPT两个基因连接后，在大多数种类细胞中至少提高4倍蛋白质量的表达，还可以通过绿色荧光蛋白报告基因的表达准确地测定假型病毒的滴度。同时C-末端插入V5标签便于纯化表达蛋白。

1.2 假型病毒制备的一般流程 制备假型病毒时，首先将目的基因插入异源启动子的多克隆位点，构建好的载体连同包装质粒共转染包装细胞293T，细胞培养48 h，超速离心收获病毒复制缺陷型假型病毒，其滴度可达10×109u/mL。VSV-G糖蛋白的使用在假型病毒基因送递中克服了宿主范围狭窄的缺陷[5-7]，如果插入其它囊膜蛋白基因，则可代替表达囊膜的包装质粒(PLP/VSVG)，可用于筛选自然宿主。表达载体携带J亚群禽白血病(ALV-J)的囊膜蛋白env基因(gp85和gp37)，目的蛋白在胞浆内表达后在信号肽的引导下定位到包装细胞的细胞膜表面，然后病毒以出芽生殖从胞浆内释放出来，新生的HIV/ALV-J病毒颗粒就携带ALV-J囊膜蛋白，具有ALV-J抗原特性，可以建立ALV-J体外中和试验，并初步应用于评价ALV-J感染鸡群中和抗体水平，同时模拟ALV-J早期感染过程来研究病毒与靶细胞间的相互作用等。自从Lagging等制备了VSV/HCV假型病毒，目前又有几种假型病毒侵染系统已经成功的建立，如鼠白血病病毒(MuLV)/猪瘟病毒(CSFV-E)、VSV-G/MuLV、HIV/H5N1(禽流感)-HA 等[8]。

2 假型病毒的应用

2.1 研究病毒与宿主细胞间的相互作用 利用假型病毒不仅能研究病毒的细胞嗜性和进入过程，还可以确定病毒的易感细胞和特异受体。研究病毒的进入过程具有以下优点：安全；外膜蛋白容易人为改造和检测；假型病毒因携带报告基因进入细胞的过程容易量化便于观察；由于假型病毒的外膜蛋白与核酸来自两种不同的病毒，因而可以将病毒的进入过程与复制过程明确分开；可以筛检特异性抑制病毒进入的化学性和免疫性物质[1]。

病毒受体的特异性决定了病毒的细胞嗜性及引起的疾病，病毒与其细胞受体的相互作用为抗病毒感染的抗体和药物的研究提供了重要的依据。利用假型病毒来研究猪瘟病毒(CSFV)在受体特性和组织嗜性上的变异，例如研究CSFV囊膜糖蛋白与病毒组织嗜性关系及糖蛋白结合受体的特性。通过扩增CSFV的囊膜蛋白基因,构建具有感染性的MuLV/CSFV-E假型病毒体系，形成假型病毒颗粒，单独研究E0或E2囊膜蛋白在细胞侵入中的功能，然后经过免疫印迹检测E012蛋白在假型病毒颗粒表面得到表达，而且形成的假型病毒MuLV-E012能够感染猪源细胞，表明在细胞表面存在CSFV的受体[9]。这些研究为筛选和评价在病毒复制早期起作用的抗病毒药物提供了大量依据。还可以研究病毒对外源基因的转导能力，构建携带CMV-EGFP报告基因表达元件的重组病毒Lenti-EGFP，通过离心转导分析对29种不同来源的哺乳动物细胞株的基因转导及表达效率，结果显示重组病毒对悬浮培养的细胞基因转移效率相对低于贴壁培养细胞，基因的表达效率不完全与转移效率成正比。表明外源基因的导入靶细胞和表达效率受多种因素的影响[10]。张松林等将高致病性禽流感病毒(AIV)H5N1亚型HA蛋白整合到HIV颗粒，包装成表达HA蛋白的假病毒粒子(HIV/H5-HA)，并对所包装的假病毒的生物学功能进行了研究[11]。结果表明，HIV/H5-HA与天然的禽流感病毒相似，具有广泛的细胞嗜性；能够凝集鸡红细胞，并且pH值依赖性测定表明，HA假病毒需要低pH值才能实现正确的入侵宿主细胞。同时假病毒模型的建立为进一步研究AIV与宿主之间的免疫应答提供了一种新的途径。

2.2 中和抗体及中和抗原表位研究 利用假型病毒进行中和抗体检测和抗原表位研究，同传统的检测方法相比具有明显的技术优势，如安全性、快速性、标准化、高通量和高度敏感性[7]，另外对于难以培养的、高致病性的病毒的研究也具有明显的优势。因此已经在AIV、HIV、CSFV及丙型肝炎(HCV)等病毒表面抗原研究中拥有广泛的应用。

在进行不同HIV候选疫苗的免疫评价时，因为没有统一的标准参考病毒株，因此难以评价不同HIV疫苗诱导产生的抗体的交叉中和作用[12]。从急性和早期的B亚型HIV感染者中克隆gp160全长基因，经过功能性筛选后，制成假型病毒，作为标准参考物来评价不同疫苗所产生的中和抗体的效价[12]。Lee等利用制备的VSVΔGHTN假型病毒免疫BALB/c小鼠，在所有的小鼠中都没有检测到针对核衣壳蛋白的结合抗体，也没有检测到汉坦病毒HTNV特异的CD8+T细胞反应，表明诱导产生的中和抗体能很好保护小鼠抵抗病毒感染，这是VSV假型病毒作为一种病毒颗粒疫苗的第一次成功应用[13]。

利用相对安全的HCV假型病毒模型不仅为我们在体外评估不同基因工程疫苗所诱导的抗HCV中和抗体及其在免疫保护中的作用提供了技术基础，而且是目前最为经济有效的手段。利用建立的分别携带H77(1a)、HeBei(1b)及J FH-1(2a)的3种不同基因型HCVE1-E2包膜蛋白的假型病毒颗粒，建立HCV体外中和试验方法，应用于评价HCV慢性感染者体内中和抗体水平。这些研究为进一步优化免疫原，探索最佳的疫苗组合与免疫策略，以及评价中和抗体在HCV感染和疾病进程中的作用，提供有力的技术支持[14]。

在研究中和抗原表位方面，可以通过构建携带乙肝病毒(HBV)抗原蛋白preS2S基因的重组MVA假型病毒颗粒，评价HBV的抗原性。将HBV-preS2S基因构建入MVA，得到重组假型病毒颗粒，表达的preS2S蛋白能够被抗HBsAb识别，具有良好的抗原性，为基因治疗HBV慢性感染做了一项实验性奠基工作[15]。闫克夏等应用高效表达SARS-CoV S蛋白的HIV慢病毒质粒及3个包装质粒载体系统共同转染人胚肾细胞293T，包装了SARS假病毒，通过SARS假病毒感染的RD-A细胞中标记基因EGFP表达的分析，确定SARS假病毒能有效进入细胞，建立了可在生物2级实验室可操作的SARS病毒中和试验技术平台[16]。

2.3 基因治疗 逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的最佳选择之一。最重要的一点是它可以有效的整合于动物靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。如果能实现有效的基因转移，基因治疗在对付动物遗传性疾病、减缓肿瘤发展、克服病毒性感染等方面都会有广阔的应用前景。这就要求在载体改造、载体的靶向性、外源基因的表达调控等诸多方面取得显著进展。用假型病毒作为转基因载体治愈效率高，而且比反转录病毒载体更有效抵抗血清补体灭活的作用，所以假型病毒应用于基因治疗实验成功的例子很多。首先是采用HIV作为基因治疗载体，它最大的特点是非细胞周期依赖的整合特性，可以高效地转染许多静止的细胞如神经元细胞、造血干细胞、肝细胞等，使以这些细胞为靶细胞的体内基因治疗成为可能。

近年来兴起的基因治疗，为肿瘤治疗开辟了崭新的领域。胸苷激酶(TK)对人胃癌细胞有杀伤作用，应用PA317细胞包装的逆转录病的介导的单纯疱疹病毒(HSV)TK基因系统成为人类胃癌体内基因治疗计划，逆转录病毒介导的酶药物预施疗法被认为可能是最有潜力的方法。王毅等采用缺陷型逆转录病毒载体介导的HSV-TK基因系统体外转染MKN28人胃癌细胞株，体外以病毒上清感染法将TK基因导入MKN28人胃癌细胞，然后整合入细胞基因组，同时观察协同作用的更昔洛韦(GCV)对转染TK基因的胃癌细胞的杀伤作用[17]。结果只有10%～20%的TK基因阳性胃癌细胞存在，在有效浓度GCV治疗后能杀伤大部分混合细胞。逆转录病毒载体携带自杀基因HSV-TK系统用于肿瘤的治疗已进行了大量的实验，体外转染有基因表达持久而稳定的特点。特别是对脑胶质瘤的治疗已进入了临床试验阶段，而且在卵巢癌腹膜种植的动物实验中也取得了很好的效果。RNA干涉(RNAi)是最近发展起来能特异性抑制哺乳动物细胞中基因表达的新技术，特别是由某些蛋白过量表达引起的疾病如肿瘤以及病毒感染等的基因治疗上具有的良好应用前景，程联胜等首次构建了基于RNAi的慢病毒载体，该病毒携带针对肿瘤表面抗原HER2的siRNA表达盒并且具有抑制高表达HER2细胞生长的特异性，有效地下调肿瘤抗原HER2的表达[18]。应用于半月板的治疗，张经纬等利用ViraPower慢病毒载体系统有效地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染入半月板纤维软骨细胞，继而促进半月板细胞的增殖和基质合成，有可能为治疗半月板损伤提供新的方法[19]。应用于传染性疾病的基因治疗，如假型病毒作为基因载体可携带多种基因转导HIV-1易感细胞，表达抗HIV-1基因，阻断或抑制病毒进入靶细胞。理论上只要阻断受体，将有效阻止HIV-1的入侵。构建慢病毒载体Plenti6/V5-R-K携带CC趋化因子，转染细胞表达后抢先占领HIV-1受体CCR5，迅速导致受体不可逆的内陷化，阻断HIV-1与受体的结合，进而阻断与靶细胞的附着和融合，显示出部分抵抗HIV感染的能力，延缓AIDS的进程，这为假型病毒用于艾滋病的基因治疗提供了新的思路[20]。

3 问题与展望

诸多的优点使假型病毒在病毒学的研究和基因治疗方面成为近年来的研究热点，但作为一种新型的基因治疗手段，其从基础研究到临床应用尚需要大量科学研究。此外，假型病毒技术也存在着许多缺点，例如基因转导的安全性、靶向性和有效性问题，它们之间是相辅相成的3个方面，在基因治疗中自然应三者兼顾。提高逆转录病毒载体转染率，可通过重复感染方法，多次将包装细胞注射到病灶周围，使其不断产生假型病毒颗粒以感染病灶细胞。另外，改变表面env蛋白可以改变载体的靶向性，如用VSV的G蛋白包装逆转录病毒基因组产生假型病毒，可拓展靶细胞范围并赋予病毒颗粒新的特性。利用组织特异性的启动子限制也可以实现目的基因表达的靶向性；采用基因重组来控制转录因子，也可控制目的基因表达的时间和表达的水平。简便、安全、高效和稳定表达，是衡量假型病毒基因转移系统的重要标准和客观指标。随着分子生物学和医学的发展，以及假型病毒自身的完善，期望基因治疗会有一个美好的前景，实现真正的临床突破，推动我国畜牧业的发展，达到基因治疗造福人类的最终目的。

[1]Dull D,Zufferey F,Kelly C,et al.A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system[J].J Virol.1998,72:8463-8471.

[2]Sanders D A.No false start for novel pseudotyped vectors[J].Curr Opin in Biotec,2002,13:437-442.

[3]Zufferey H,Dull S,Mandel P,et al.Selfinactivating lentivirus vector for safe and efficient in vivo gene delivery[J].Virology,1998,72:9873-9880.

[4]Park F,Kay M A.Modified HIV-1 based lentiviral vectors have an effect on viral transduction efficiency and gene expression in vitro and in vivo[J].Mol Ther,2001,4(3):164-173.

[5]Burns D,Driever F,Friedmann C,et al.Concentration to a very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells[J].Sciences,1998,90:8033-8037.

[6]Emi,Yee,Friedmann,et al.Pseudotype for mation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus[J].Virology,1991,65:1202-1207.

[7]Yee,LaPorte,Miyanohara,et al.A General Method for the generation of high-titer,Pantropic Retroviral Vectors:Highly Efficient Infection of primary hepatocytes[J].Sciences,1994,91:9564-9568.

[8]Lagging L M,Meyer K,Owens R J.Functional role of hepatitis Cvirus chimeric glycop roteins in the infectivity of pseudotyped virus[J].J Virol,72(5):3539-3546.

[9]周斌，党占国，刘珂，等.整合猪瘟病毒囊膜蛋白的假型鼠白血病病毒感染性的研究[J].南京农业大学学报，2008，31(4)：97-101.

[10]张雅丽，程通，蔡毅君，等.重组慢病毒对不同哺乳动物细胞基因转移及表达效率的研究[J].厦门大学学报，2008，47(3)：392-396.

[11]张松林，金梅林，肖凌云，等.整合HA蛋白的HIV假病毒展示禽流感病毒感染宿主细胞机制[J].中国生物化学与分子生物学报，2008，24(4)：366-372.

[12]Li M,Gao F,Mascola J R,et al.Human immunodeficiency virus type 1envclones from acute and early subtype B infections for standardized assessments of vaccine-elicited neutralizing antibodies[J].J Virol,2005,79:10108-10125.

[13]Lee B H,Yoshimatsu K,Araki K.A pseudotype vesicular stomatitis virus containing Hantaan virus envelope glycoproteins G1 and G2 as an alternative to hantavirus vaccine in mice[J].Vaccine,2006,24(15):2928-2934.

[14]张柯，谭文杰，邓瑶，等.三种丙型肝炎包膜感染性假病毒颗粒的制备及初步应用研究[J].病毒学报，2008，24(4)：287-294.

[15]栾翔凌，刘素君，胡燕，等.表达HBV preS2S基因重组MVA假病毒颗粒的构建及抗原性鉴定[J].传染病信息，2008，21(3)：155-157.

[16]闫克夏，谭文杰，张相民，等.SARS-CoV假病毒中和试验技术的建立及评价[J].病毒学，2007，23(6)：440-446.

[17]王毅，胡志前，徐学俊，等.逆转录病毒介导的HSV-TK基因系统对人胃癌细胞的转染及杀伤作用[J].第二军医大学学报，2001，22(4)：328-330.

[18]程联胜，查昭，席甲甲，等.慢病毒介导的RNA干涉对乳腺癌SKBR3细胞HER2受体的下调及生长抑制[J].中国生物工程杂志，2007，27(2)：1-8.

[19]张经纬，冯建翔，徐荣明，等.慢病毒介导碱性成纤维细胞生长因子基因转染促进半月板纤维软骨细胞的增殖与基质合成[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(41)：8267-8270.

[20]孙利，张颖，黄长形，等.RANTES-K慢病毒载体的构建及其慢病毒的产生和鉴定[J].第四军医大学学报，2009，30(3)：247-250.