舟山沿海贝类产品中副溶血性弧菌的检测与毒力基因分析

刘慧慧，薛超波

(1.浙江海洋学院海科学院，浙江舟山316002；2.舟山市质量技术监督检测院，浙江舟山316021)

副溶血性弧菌是我国一种重要的食源性病原菌，可引起急性胃肠炎，少数情况还能引发败血病，危及生命。该菌引发的疾病居微生物性食源性疾病暴发之首，而且发病人数呈显著上升趋势[1-5]。舟山作为沿海城市，由于水产品的消费量较大且某些居民有生食海鲜的习惯，副溶血性弧菌成为主要的食源性致病菌。本研究以副溶血性弧菌具有种特异性的不耐热溶血素(tlh)基因为靶基因，建立了副溶血性弧菌的实时荧光定量PCR检测方法，并利用该方法结合常规培养方法对舟山地区的海产贝类中的副溶血性弧菌进行检测，同时对分离的副溶血性弧菌进行了血清分型和毒力基因分析。

1 材料和方法

1.1 菌株和抗血清 副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法建立所需菌株购自中国药品生物制品检定所，包括副溶血性弧菌标准菌株1株(菌种号：ATCC 17802)；阴性对照菌株7株，即大肠埃希氏菌(菌种号：ATCC 44113)、宋内氏志贺菌(菌种号：ATCC 51592)、鸭沙门氏菌(菌种号：ATCC 51002)、溶藻弧菌(菌种号：ATCC 17749)、霍乱弧菌(菌种号：ATCC 25872)、嗜水气单胞菌(菌种号：ATCC 7966)、弗氏柠檬酸杆菌(菌种号：ATCC 13316)各1株。耐热溶血素(tdh)基因阳性、阴性参考菌株为浙江省疾病预防控制中心(CDC)收集的临床菌株。VP诊断血清购自日本生研株式会社。

1.2 样品来源及处理 2008年选择舟山市3个较大的具有代表性的农贸市场，共采样3次，采样时间分别为4月、8月和10月份，每次分别随机采集鲜活贝类20份。样品种类包括泥螺、贻贝、泥蚶、缢蛏、毛蚶等10种，样品采集后1 h～2 h内送实验室进行处理。处理时，先冲净表面，用无菌器械凿碎外壳，取可食部分放置于无菌平皿内，称取25 g于无菌塑料袋内，加入225 mL碱性蛋白胨水，采用BAGxer-400均质器拍击3 min，置37℃培养箱内培养18 h后，划线接种于科玛嘉显色培养基平板和TCBS平板上，同时移取5 mL增菌液于无菌试管中，置-20℃保存，供PCR检测使用。

1.3 主要试剂 API 20NE试剂条，氧化酶(Oxydase)试剂均购自法国bioMerieux公司；碱性蛋白胨水(APW)、硫代硫酸柠檬酸盐蔗糖(TCBS)琼脂均购自杭州天和微生物试剂有限公司、科玛嘉弧菌显色培养基为法国科玛嘉产品；VP毒力基因tdh检测试剂盒购自上海宝生科技发展有限公司；实时荧光定量2×PCR快速反应液、DNA标准品稀释液购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.4 实时荧光定量PCR的引物与TaqMan探针设计 利用Primer Express 2.0生物软件，根据Gen-Bank中副溶血性弧菌(AY-289609)全基因序列上tlh基因区设计副溶血性弧菌检测通用引物与TaqMan探针，引物和探针序列如下：TLH-F 5'-CACGCATT GCGCTCTGAG-3'，TLH-R 5'-CGTGACATCCCAGAA CACAAA-3'， TLH-Probe： 5'-TGCGGCGTCTGGTGC TGA-3'，引物和探针由上海生物工程技术服务公司合成。同时，根据GenBank中登录的副溶血性弧菌基因组tdh基因的保守序列，采用Primer软件设计PCR引物，tdh的上游引物为TDH-F 5'-AGCTTCCA TCTGTCCCTTTT-3'，下游引物为 TDH-R 5'-ATTAC CACTACCACTCTCATA-3'。

1.5 实时荧光定量PCR反应体系与扩增条件 2×PCR 快速反应液 10 μL(内含 Buffer、Ex Tag HS、dNTP Mixture、Mg2+等)， 上下 游引 物(10 μmol/L)、TaqMan 探针(3 μmol/L)各 0.4 μL，无菌双蒸水 6.8 μL，模板2.0 μL，反应总体积20 μL。反应条件：95℃10 s；94℃ 5 s、60℃ 20 s， 40个循环，于60℃采集荧光信号。

1.6 细菌基因组DNA的提取 取各菌株和检测样品的增菌液1 mL于1.5 mL Eppendorf管，15000 r/min高速离心1 min，弃上清，加100 μL DNA提取剂混匀后，100℃水浴2 min，15000 r/min高速离心1 min，取上清液备用，置-20℃保存。

1.7 副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法的灵敏度分析 为验证方法的灵敏度，取标准副溶血性弧菌(菌号为ATCC 17802)做为灵敏度分析的代表菌株。将复苏后的副溶血性弧菌接种于碱性蛋白胨水中，36℃培养12 h，进行10倍稀释，共做8个稀释度，按1.2.5方法提取细菌DNA，进行实时荧光定量PCR检测。同时参照《食品卫生微生物学检验菌落总数的测定》(GB/T 4789.2-2003)方法做菌落计数，推算出原液的细菌含量。

1.8 副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法的特异性试验 以大肠艾希菌、宋内氏志贺菌、鸭沙门氏菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌为阴性对照，副溶血性弧菌为阳性对照，分别提取核酸，用本研究建立的方法进行检测，验证方法的特异性。

1.9 结果判定标准 阈值设定原则为超过阴性对照扩增线(无规则噪音线)的最高点。Ct值≥40为阴性，Ct值＜40为阳性，Ct值在38～40之间的标本需重新测定一次，再按上述要求进行判定。

1.10 副溶血性弧菌的分离与鉴定 初步观察检查平板上生长的菌落形态，每板挑取2个～3个可疑菌落，分别穿刺接种于3.5%NaC1三糖铁琼脂和半固体琼脂。挑取三糖铁模式符合副溶血性弧菌特征的菌落进行生化试验。生化鉴定采用法国梅里埃API 20E细菌鉴定系统，同时进行嗜盐性实验确定。

1.11 副溶血性弧菌的血清学分型 取分离到的副溶血性弧菌单个菌落接种于3.5%NaCl胰蛋白胨斜面，36℃培养24 h，用含3%NaCl的5%甘油溶液冲洗下斜面上的细菌，121℃高压灭菌1 h，灭菌后4000 r/min离心15 min，弃上层液体，沉淀用生理盐水洗3次，每次4000 r/min离心15 min，最后一次离心后留少许上层液体，将细胞桨弹起制成菌悬液。各取1滴O群血清和菌悬液滴加到玻片上充分混合，同时用生理盐水做阴性对照，阳性凝集反应可于1 min内观察到。

1.12 副溶血性弧菌tdh毒力基因检测 模板的制备：取增菌液100 μL，12000 r/min离心5 min，弃上清液，加入100 μL DNA提取液于沉淀中，振荡混匀。置100℃水浴加热10 min～15 min，10000 r/min离心1 min，保留上清待用。PCR反应体系为21 μL，含Tris-HCl、Taq酶、引物、dNTP及模板DNA，反应程序为：94℃5 min；94℃30 s、56℃40 s、72℃90 s，35个循环；72℃3 min。PCR产物检测：用含0.5 μg/mL溴化乙锭的 2%琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物为382 bp，以67 bp～501 bp的Marker为对照，紫外灯下观察实验结果是否有毒力基因tdh的扩增片段。

2 结果

2.1 菌落计数 经细菌培养计数，以10-7稀释度计算出原菌液的细菌浓度为2×108cfu/mL。

2.2 实时荧光定量PCR检测副溶血性弧菌方法的线性范围与灵敏度 以副溶血性弧菌阳性标准菌株梯度稀释菌悬液浓度(l03cfu/mL、l04cfu/mL、105cfu/mL、l06cfu/mL、107cfu/mL、108cfu/mL)的对数值作横坐标，其相应测定的Ct值作纵坐标，得到标准曲线(图 1)。其斜率为 -3.508，截距为 38.97，相关系数为-0.99，从而得出细菌拷贝数与Ct值的线性关系：Ct=-3.508 Log concentration+38.97，标准曲线呈良好的线性关系(r＝-0.99)，检测下限为2×101cfu/mL。

2.3 实时荧光定量PCR检测副溶血性弧菌方法的特异性试验 在40个循环内，除副溶血性弧菌出现阳性结果外，大肠埃希氏菌、宋内氏志贺菌、鸭沙门氏菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌等细菌的检测结果均为阴性(图2)。这表明本研究建立的荧光定量PCR检测方法对副溶血性弧菌有很好的特异性，与其他相关肠道细菌无交叉反应。

2.4 实时荧光定量PCR检测副溶血性弧菌的重复性 对6种不同浓度的副溶菌DNA样本菌液重复检测3次，得到的Ct值进行汇总(表1)，6种浓度菌液检测的结果均能判断为阳性，而且Ct值变异系数在合理范围内(最大为2.26%，均小于5%)，通过实验表明，该体系重复性好，稳定性高。

表1 实时荧光定量PCR检测副溶血性弧菌稳定性实验Table 1 The stability test of real-time PCR detection system ofVibrio parahaemolyticus

2.5 舟山沿海贝类产品中副溶血性弧菌的检测结果在TCBS平板上副溶血性弧菌的形态为：中等大小的草绿色圆形菌落，有时略呈蓝色，直径2 mm～3 mm中心略隆起，无蔓延生长。有粘性，不易挑取。在科玛嘉显色培养基上副溶血性弧菌典型的菌落为：中等大小的紫色圆形隆起菌落，有时边缘趋于更浅淡的紫色，浑浊不透明，不呈黑色或灰色，直径1 mm～3 mm，偶见轻微蔓延生长。60份鲜活贝类产品中，采用常规的分离培养方法，有50份检出副溶血性弧菌，阳性率为83.33%；而采用实时荧光定量PCR检测方法，全部检出副溶血性弧菌，具体检测结果见表2。

表2 贝类产品中副溶血性弧菌的检测结果Table 2 The detection ofVibrio parahaemolyticusin seashells

2.6 副溶血性弧菌血清分群 分离得到的50株副溶血性弧菌分布于 5个 O抗原群(Ol、O3、O4、O5、O8)，其中O5为主要抗原群，占62%(31/50)，O3 占 10%(5/50)。

2.7 副溶血性弧菌毒力基因tdh检测结果 对分离到的50株副溶血性弧菌进行tdh基因检测，结果46株tdh阴性，4株tdh阳性。

3 讨论

本研究首次对舟山地区海产贝类中的副溶血性弧菌污染情况进行了调研，研究结果显示，舟山地区海产贝类中副溶血性弧菌污染情况严重，60份鲜活贝类产品中，采用常规的分离培养方法，有50份检出副溶血性弧菌，阳性率为83.33%，而采用实时荧光定量PCR检测方法，全部检出副溶血性弧菌，阳性率为100%。这与舟山地处沿海地区，海洋环境中本身含有大量的副溶血性弧菌，而贝类作为一种“非选择性滤食”的海洋生物，对环境污染物包括病原微生物的“富集”能力强有关。

尽管副溶血性弧菌是引起食物中毒的重要病原菌，但大多数的副溶血性弧菌没有致病性。tdh(耐热直接溶血毒素)被公认为是副溶血性弧菌的主要毒力因子，流行病学调查也表明副溶血性弧菌的致病力同其有高度的相关性[6-8]。我们对分离到的副溶血性弧菌菌株进行了tdh基因检测，结果46株tdh阴性，4株tdh阳性，且均为8月份分离到的菌株。说明舟山沿海地区的贝类产品中尽管普遍携带副溶血性弧菌，但大多不能直接引起人体发病，而且副溶血性弧菌不耐热，56℃加热5 min，或90℃加热1 min即可将其灭活[9-10]，因此，只要采取合理的烹调方式，可以有效的预防因食用海产贝类而引起的食物中毒。

本研究以tlh基因为靶基因建立的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法，具有快速、准确、可定量的优点，可在1 d内完成全部检测，特异性强，与其他细菌无交叉反应，灵敏度高，检测下限可达到2×101cfu/mL，可广泛应用于海产品和食物中毒标本中的副溶血性弧菌的快速检测。

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