雌激素受体α基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究*

孙 青， 孔丽娜， 宋蓉蓉， 李铁臣

(1皖南医学院弋矶山医院妇产科，安徽 芜湖 241001;2皖南医学院分子生物学研究室，安徽 芜湖 241002)

子宫内膜异位症(endometriosis)是妇科最常见的疾病之一，患者表现为疼痛、不孕及其它症状［1－6］。子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性疾病［3－5］，育龄妇女中的发病率约 5% － 10%［1，2，4－6］，近年来，发病率逐年上升，其中近50%的患者导致不孕［1，4］，总体复发率高达 50% 以上［7］。目前，子宫内膜异位症的发病机制尚不清楚［1，2］。有研究表明雌激素受体 α(estrogen receptor α，ERα)基因的 PvuⅡ和XbaⅠ的多态性可能参与了异位子宫内膜的种植过程［2－4，6］，本研究采用 PCR －RFLP 和 DNA 序列测定方法检测子宫内膜异位症患者和正常对照中这2个多态位点的分布情况，探讨ERα基因多态性在子宫内膜异位症发生中的作用。

材料和方法

1 临床资料

60例子宫内膜异位症标本全部来自2007年12月至2009年10月弋矶山医院妇产科，均为妇科开腹或腹腔镜手术中无菌采集的新鲜组织标本，全部为卵巢子宫内膜异位症病例，取典型病灶部位。患者无特殊疾病史，术前3个月内未采用过激素治疗，年龄22－50岁，平均年龄(37.5±6.6)岁。根据美国生育学会修正分期法(the revised American Fertility Society，r－AFS)(1985)分期:Ⅰ期7 例，Ⅱ期 21 例，Ⅲ期22例，Ⅳ期10例。

56例正常对照标本全部来自2008年1月至2008年10月弋矶山医院妇产科，均为门诊行诊断性刮宫的育龄妇女的正常子宫内膜，增生期宫内膜34例，分泌期宫内膜22例，年龄32－58岁，平均年龄(43.0±6.2)岁。

以上所有标本均经镜下病理检查证实。

2 PCR

取50 mg左右的组织，加入细胞裂解液进行组织匀浆，匀浆经蛋白酶K消化，常规酚－氯仿抽提DNA，紫外分光光度计检测DNA纯度和浓度，4℃保存、备用。

根据GenBank数据［NC_000006.11(152129500－152163731)］自行设计了1对PCR引物，上游引物序列为 5'－TCCAGGGTTATGTGGCAATGACG－3'，下游引物序列为5'－ACTACCTGCACCAGAATATGTTACCT－3'，扩增的片段大小为278 bp，涵盖 ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ2个多态位点。

PCR 总反应体积50 μL:模板 DNA 为2 μL，Taq酶2.5 U，10 ×buffer 5 μL，MgCl21.5 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，上游及下游引物各 10 pmol/L，加ddH2O至总体积50 μL。反应在PTC－150型热循环仪(MJ公司)上进行，98℃ 5 min蛋白变性后，加入Taq酶(Promega产品)，进入热循环，反应条件为:94℃ 30 s;56℃ 40 s，72℃ 1 min，共35个循环，最后72℃ 4 min。取10 μL PCR扩增产物加样，1.5%琼脂糖凝胶电泳60 min(电压100 V)，溴化乙啶(ethidium bromide，EB)染色，紫外灯下检测扩增产物，4℃保存备用。

3 限制性内切酶酶切

限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ为Fermentas产品(#ER0631和#ER0681)，酶切反应总体积 32 μL:PCR 产物10 μL，10 ×buffer 2 μL(PvuⅡ为10 ×buffer G，XbaⅠ为 10 ×buffer Tango)，PvuⅡ或 XbaⅠ2 μL，加 ddH2O 至总体积32 μL。37 ℃水浴2－3 h，10 μL酶切产物加样，1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压100 V)，EB染色，紫外灯下检测结果，数码相机摄片保存。

4 DNA序列测定

PCR产物经DNA凝胶纯化试剂盒(Axygen产品)纯化回收，50 μL纯化后的PCR产物连同其上、下游引物由南京金斯瑞生物科技有限公司，在ABI－3730XL测序仪上进行单向测序(双脱氧法)，必要时进行双向测序，观察 PvuⅡ和 XbaⅠ多态位点的状况。

5 统计学处理

数据用计数资料的构成比表示，各组间阳性表达率采用SPSS 10.0软件包进行χ2检验。

结 果

所有标本均出现278 bp目标带。PvuⅡ酶切后，可产生 3种片段:278 bp、179 bp、99 bp，只有 1条278 bp带的为PP(CC)型(突变型)，有179 bp、99 bp 2条带的为pp(TT)型(野生型)，3条带的为Pp(TC)型(杂合型)，相应的测序结果PvuⅡ酶切位点的序列分别为:CAGCCG、CAGCTG和CAGCT/CG(T/C杂合)，见图1－3。XbaⅠ酶切后，也可产生3种片段:278 bp、144 bp、134 bp，只有 1 条 278 bp 带的为 XX(GG)型(突变型)，有144 bp、134 bp 2条带的为 xx(AA)型(野生型)，3条带的为 Xx(AG)型(杂合型)，相应的测序结果XbaⅠ酶切位点的序列分别为:TCTGGA、TCTAGA和 TCTA/GGA(A/G杂合)，见图4－6。

Figure 1.The photograph of PvuⅡdigestion in endometriosis.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1，2:homozygous mutant－type(C/C);Lane 3－5:homozygous wild－type(T/T);Lane 6－10:heterozygous genetype(T/C).图1 子宫内膜异位症组中PvuⅡ酶切结果

Figure 2.The photograph of PvuⅡdigestion in normal endometrium.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1，2:homozygous mutant－type(C/C);Lane 3－6:homozygous wild－type(T/T);Lane7－10:heterozygous genetype(T/C).图2 正常对照组中PvuⅡ酶切结果

PP型、Pp型、pp型、XX型、Xx型、xx型在子宫内膜异位症组和正常对照组中的分布见表1、2，经χ2检验，2组间差异无显著(P ＞0.05)，P、p以及 X、x的基因频率在2组间差异也无显著(P＞0.05)。

Figure 3.The sequence graph of PvuⅡrestriction sites.A:homozygous mutant－type(C/C);B:homozygous wild－type(T/T);C:heterozygous genetype(T/C).图3 PvuⅡ酶切位点测序结果

Figure 4.The photograph of XbaⅠdigestion in endometriosis.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1:homozygous mutant－type(G/G);Lane 2－7:homozygous wild－type(A/A);Lane 8－11:heterozygous genetype(A/G).图4 子宫内膜异位症组中XbaⅠ酶切结果

Figure 5.The photograph of XbaⅠdigestion in normal endometrium.M:100 bp DNA ladder marker，from down to up:100 bp，200 bp，300 bp，400 bp…;Lane 1:homozygous mutant－type(G/G);Lane 2－6:homozygous wild－type(A/A);Lane 7－11:heterozygous genetype(A/G).图5 正常对照组中XbaⅠ酶切结果

Figure 6.The sequence graph of XbaⅠrestriction sites.A:homozygous mutant－type(G/G);B:homozygous wild－type(A/A);C:heterozygous genetype(A/G).图6 XbaⅠ酶切位点测序结果

表1 ERα基因PvuⅡ多态性基因型和等位基因在子宫内膜异位症组和正常对照组中的分布Table 1.Genetype and allele distribuition of ERα gene PvuⅡpolymorphisms in endometriosis and normal endometrium［n(%)］

2种酶切结果组合分析，没有出现PpXX、ppXX和ppXx 3种类型，其余基因型在2组间的分布见表3，经χ2检验，2组间差异无显著(P＞0.05)。PP型、Pp型、pp型、XX型、Xx型、xx型在子宫内膜异位症轻度患者组(Ⅰ、Ⅱ期)和重度患者组(Ⅲ、Ⅳ期)中的分布见表4、5，经χ2检验，2组间差异无显著(P＞0.05)。

表2 ERα基因XbaⅠ多态性基因型和等位基因在子宫内膜异位症组和正常对照组中的分布Table 2.Genetype and allele distribuition of ERα gene XbaⅠpolymorphisms in endometriosis and normal endometrium［n(%)］

表3 ERα基因多态性基因型在子宫内膜异位症组和正常对照组中的分布Table 3.Genetype distribuition of ERα gene polymorphisms in endometriosis and normal endometrium(n)

表4 ERα基因PvuⅡ多态性基因型在子宫内膜异位症轻度患者组和重度患者组中的分布Table 4.Genetype distribuition of ERα gene PvuⅡ polymorphisms in patients with endometriosis stage I/II and stage III/IV(n)

表5 ERα基因XbaⅠ多态性基因型在子宫内膜异位症轻度患者组和重度患者组中的分布Table 5.Genetype distribuition of ERα gene XbaⅠ polymorphisms in patients with endometriosis stage I/II and stage III/IV(n)

讨 论

ERα基因位于6q25.1，长度大于140 kb，包含8个外显子，7个内含子［8］，在第1内含子内有2个单核苷酸多态位点，可通过限制性内切酶PvuⅡ和XbaⅠ酶切来检测［2－4，9，10］。ERα 是核受体，具有转录因子作用，能调控其下游基因的活性［4］。一些研究表明，ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ的多态性对雌激素应答的调节功能有影响，由此可能会对一些雌激素依赖性疾病(如子宫内膜异位症)的发病产生作用［4，11］。

ERα基因的多态性与乳腺肿瘤和骨质疏松症发生之间的关系已被证实，但与子宫内膜异位症之间的关系尚有待进一步研究［11］。Govindan等［3］对110例印度的子宫内膜异位症患者和115例正常对照进行了研究，结果发现ERα基因的PvuⅡ多态性CC基因型是印度妇女子宫内膜异位症发生的危险标志。Xie等［2］和 Hsieh 等［4］分别对中国大陆和台湾的子宫内膜异位症患者进行了研究，认为ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ多态性与子宫内膜异位症的发生密切相关。但Sato等［9］在对巴西人子宫内膜异位症的发生与ERα基因多态性的相关性研究中，得到了相反的结论，他们没有发现子宫内膜异位症患者和正常对照组之间ERα基因的多态性有显著差异。Kim等［10］也没有发现韩国人的子宫内膜异位症的发生与ERα基因多态性相关。Luisi等［6］在意大利患者中，仅发现子宫内膜异位症的复发可能与ERα基因的多态性相关。

本实验采用限制性内切酶酶切和DNA序列测定2种方法对ERα基因的多态性在子宫内膜异位症发生中的作用进行了研究，结果表明，ERα基因的PvuⅡ和XbaⅠ的多态性在子宫内膜异位症组和正常对照组中的分布，差异无显著(P＞0.05)，与Sato等［9］、Kim 等［10］和 Luisi［6］等的观点一致，而与 Xie等［2］、Govindan 等［3］和 Hsieh 等［4］的不同。这可能与采用的实验方法不同有关，上述的研究均是仅采用限制性内切酶酶切方法得到的结果，本实验开始时，也是按文献报道［2，4］的引物(上游 5'－ CTGCCACCCTATCTGTATCTTTTCCTATTCTCC －3'，下游 5'－TCTTTCTCTGCCACCCTGGCGTCGATTATCTGA－3'，PCR产物1374 bp)进行的实验，发现酶切结果的重复性不尽理想，部分标本PCR产物酶切后的残留条带对结果的评判有影响，于是重新自行设计了1对PCR引物，采用限制酶酶切和DNA测序2种方法进行研究，当两者结果不符时，则重新摸索酶切条件并进行反向测序验证，结果发现DNA测序结果的重复性较高，优于酶切的结果。

综上所述，ERα基因的多态性与子宫内膜异位症发生之间的关系尚需作进一步的研究，扩大研究标本量和采用DNA序列测定的方法是必要的。

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