异补骨脂素对人晶状体上皮细胞雌激素受体表达的上调作用*

黄秀榕， 祁明信， 张可丽， 郭 娜

(福建中医药大学1病理生理研究中心，2附属第二人民医院眼科，福建 福州 350003)

近年来的流行病学调查研究和实验研究结果［1，2］从不同角度表明老年性白内障与雌激素间存在一定的相关性。在核性、后囊下和皮质性白内障3种类型之中，女性白内障的患病率都高于男性，而当服用雌激素后，女性核性白内障患病率有所下降;单独应用雌激素或雌激素－孕激素联合应用的激素替代疗法与降低白内障的风险有联系，绝经后使用雌激素可减少白内障的发生，对晶状体透光性有保护作用;典型闭经的激素水平与白内障的发生也有显著的依从性;在对SD大鼠应用甲基亚硝脲诱导的年龄相关性白内障模型中研究发现，去卵巢后未予雌激素组晶状体混浊眼数较给予雌二醇或雌酮组高，未用雌激素组晶状体透光率较使用雌激素组低;抗雌激素药他莫昔芬使用5年以上可增加发生白内障的危险，这可能与阻断晶体氯离子通道而导致晶状体混浊有关。而近年的实验研究表明，很多富含植物雌激素的中药，如补骨脂、牛膝、葛根、淫羊藿、黑升麻、虎杖等具有类雌激素活性［3］，异补骨脂素(isopsoralen，ISR)为中药补骨脂的有效单体，归肾、脾经，温肾助阳，肾属水，肝属木，水可生木，即肾可生肝，而肝开窍于目。本实验选取ISR作用于H2O2处理的人晶状体上皮细胞(human lens epithelial cells，HLECs)，探讨其对老年性白内障的防治作用。

材料和方法

1 材料

1.1 仪器 流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)(BD FACScan)、CO2培养箱(FORMA 2111)、倒置相差显微镜(Olympus IMT－413)、超净工作台(江苏SW－CJ－IF)、微量移液器(Gilson)、冰箱(青岛BCD－268)、超低温冰箱(MDF－V5410)、电热式压力消毒器(上海 YXQ.SG41)、数字酸度计(上海 PHS－25)、微量电子天平(上海FA200X)、低速水平离心机(北京LD4－2)、恒温水浴锅(深圳HH－4)、干燥箱(上海101A－2)、自动三重纯水蒸馏器(上海SZ－97)、真空泵(EF006)。

1.2 试剂 雌二醇(β －estradiol，E2)粉末，纯度97%，Sigma;ISR粉末，购自中国药品生物制品检定所;胰蛋白酶(trypsin)为美国Gibco产品，乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)为 Augus产品，购自华美生物工程公司;DMEM培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)干粉为Gibco产品，牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)为Amresco产品，新生牛血清(newborn calf serum，NCS)为奥地利PAA产品，购自厦门泰京生物技术有限公司;HEPES为 Amresco产品，Triton X－100、NP－40为Sigma产品，购自厦门鹭隆生物技术有限公司;兔抗人ERα、β多克隆抗体为Santa Cruz产品，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗兔抗体，购自北京中山生物技术有限公司;青霉素系福建汇天生物药业有限公司产品，链霉素为大连美罗大药厂产品;其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 HLECs培养 取出保存冻存细胞的冻存管立即放入37℃水中，将溶解的细胞悬液用10倍体积以上的培养液进行稀释，离心，除上清，反复洗涤3次。以5×108cells/L接种于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱培养。待细胞生长融合后进行传代培养。

2.2 E2溶液配制 取 E2粉末0.0136 g，溶于0.5 mL无水乙醇，待完全溶解后，加无水乙醇至5 mL，配制成10－2mol/L的储存液，分装，－20℃冻存备用，临用前用灭菌后的三蒸水稀释成10－4mol/L的工作液。

2.3 ISR溶液配制 取ISR粉末0.0091 g，溶于0.5 mL无水乙醇，待完全溶解后，加无水乙醇至5 mL，配制成10－2mol/L的储存液，分装，－20℃冻存备用，临用前用灭菌后的三蒸水稀释成10－4mol/L的工作液。

2.4 核分离液配制 分别称取BSA 0.5 g，HEPES 0.59575 g，依次将其溶解于80 mL PBS(溶解时必须待一种试剂完全溶解后，再加入下一种试剂，直至所有试剂溶解后混匀)，加入0.6 mL NP－40，补加PBS至100 mL混匀，4℃保存备用。

2.5 反应缓冲液配制 称取BSA 2.5 g，将其溶解于180 mL PBS，加入 0.125 mL Triton X －100，补加PBS至200 mL混匀，4℃保存备用。

2.6 分组与给药 对照组:HLECs+含10%NCS的DMEM培养液;H2O2组:对照组 +3×10－4mol/L H2O2;E2组:H2O2组 +10－8mol/L E2;ISR 组(高浓度):H2O2组 +10－5mol/L ISR;ISR组(中浓度):H2O2组+10－6mol/L ISR;ISR组(低浓度):H2O2组+10－7mol/L ISR。

各ISR组提前加药孵育1 h后，再加入H2O2，培养24 h后进行检测。

2.7 FCM检测经H2O2处理的HLECs上雌激素受体 α(estrogen receptor α，ERα)和 β(ERβ)的表达取对数期生长的细胞，常规消化，收集，细胞密度为(1－2)×109cells/L，PBS洗涤1次，每组设7个平行样本(其中一个为阴性对照);用－20℃预冷的100% 甲醇－20℃固定20 min;PBS洗涤2次，用4℃预冷的核分离液室温处理10 min，用反应缓冲液洗涤2遍;加入含有1%BSA及1%NCS的 PBS 50 μL，混匀后室温中放置30 min;反应缓冲液洗涤2遍，分别加入1∶100稀释(稀释液为0.01 mol/L的磷酸钠缓冲液，pH7.6)的Ⅰ抗(ERα抗体、ERβ抗体)，4℃反应过夜(阴性对照组以PBS代替Ⅰ抗，其它步骤同前，以便试机、调零)，然后用反应缓冲液洗涤2遍;加入1∶50稀释(稀释液为0.01 mol/L的磷酸钠缓冲液，pH 7.6)的FITC标记的Ⅱ抗，置冰上避光放置30 min;反应缓冲液洗涤2遍，加入1 mL PBS悬浮细胞，上机做流式细胞分析，检测ERα、ERβ蛋白阳性率。

3 统计学处理

结 果

1 FCM检测ISR对经H2O2处理的HLECs ERα表达的影响

FCM检测结果显示(表1、图1):正常HLECs存在ERα的表达;H2O2组HLECs内ERα表达明显下降，与对照组比较有显著差异(P＜0.01);E2、ISR高、中、低浓度组的HLECs内ERα表达明显升高，与H2O2组比较有显著差异(P＜0.01);且随ISR浓度的增高HLECs内ERα表达逐渐升高，呈明显的浓度依赖关系。

表1 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ERα表达的影响Table 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in HLECs incubated with H2O2(.n=6)

表1 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ERα表达的影响Table 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in HLECs incubated with H2O2(.n=6)

＊＊P ＜0.01 vs control group;▲▲P ＜ 0.01 vs H2O2group.

Group ERα(%)Control 33.552 ±2.147 H2O2 21.428 ±1.491＊＊E2 31.470 ±1.536▲▲ISR(10 －5mol/L) 36.350 ±2.498▲▲ISR(10 －6mol/L) 31.402 ±1.940▲▲ISR(10 －7mol/L) 25.390 ±0.722▲▲

Figure 1.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERα in H2O2－treated HLECs examined by flow cytometry.图1 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ERα表达的影响

2 FCM检测ISR对经H2O2处理的HLECs ERβ表达的影响

FCM检测结果显示(表2、图2):正常HLECs存在ERβ的表达;H2O2组HLECs内ERβ表达明显下降，与对照组比较有显著差异(P＜0.01);E2、ISR高中低浓度组的 HLECs内 ERβ表达明显升高，与H2O2组比较有显著差异(P＜0.01);且随ISR浓度的增高HLECs内ERβ表达逐渐升高，呈明显的浓度依赖关系。

表2 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ERβ表达的影响Table 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ of HLECs incubated with H2O2(.n=6)

表2 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ERβ表达的影响Table 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ of HLECs incubated with H2O2(.n=6)

＊＊P ＜ 0.01 vs control group;▲▲P ＜0.01 vs H2O2group.

Group ERβ(%)Control 27.208 ±1.633 H2O2 15.702 ±0.613＊＊E2 25.478 ±0.906▲▲ISR(10 －5mol/L) 29.950 ±4.526▲▲ISR(10 －6mol/L) 26.120 ±2.801▲▲ISR(10－7mol/L)18.025 ±0.540

Figure 2.The effect of different concentrations of ISR on expression of ERβ in H2O2－treated HLECs examined by flow cytometry图2 FCM检测不同浓度ISR对经H2O2处理的HLECs ERβ表达的影响

讨 论

氧化损伤是诱发老年性白内障形成的一个重要因素，如各种原因和途径导致的晶状体氧自由基产生过多或清除过少，均可引起HLECs和纤维组织的损伤而导致老年性白内障的发生。

ER是类固醇激素受体超大家族中的一员，人体内有2种雌激素受体，即ERα和ERβ。雌激素的生物效应主要是通过与ER结合而发挥作用［4］。已有相关研究结果证实了HLECs上有ER的表达，并在亚细胞器上的定位进行了研究［5－7］。本研究结果表明:正常HLECs上存在ERα、β表达，与国内外学者的报道结果一致。国外学者报道了氧化损伤能影响ERα、β的表达［8］。本研究表明:H2O2能下调HLECs的ERα、β表达，提示由H2O2诱导的氧化损伤参与的老年性白内障可能与HLECs的ERα、β下调有关。

近年来有相关文献报道了E2对氧化损伤的HLECs的保护作用:Wang等［9］的研究结果表明了E2对体外培养的HLECs氧化应激的保护效应:将HLECs暴露于H2O2可引起细胞生存力、胞内ATP水平和线粒体膜电位三者呈剂量依赖性下降;而用E2预处理的HLECs，前两者均呈剂量依赖性提高，此研究首次在HLECs中证实雌激素具有抗氧化作用。Moor等［10，11］研究发现 E2在保护 HLECs免受氧化损伤中，稳定线粒体膜电位起了关键作用;在H2O2处理的HLECs中，E2诱导ERK1/2磷酸化与稳定线粒体膜电位呈正相关，故可能在E2活化MAPK信号通路与稳定线粒体膜电位来发挥17β－E2的抗氧化、细胞保护作用的能力之间存在联系，这可能是E2抗氧化的机制之一。Flynn等［12］进一步研究发现:在高糖条件下培养的牛HLECs持续产生多羟化合物，多羟化合物的聚集促进线粒体膜去极化，预先用E2处理HLECs可阻止线粒体膜电位的增加，对抗线粒体膜去极化。Gottipati等［13］的研究表明，E2可快速活化HLECs线粒体相关的锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，MnSOD)而不影响其 mRNA和蛋白的表达，推测MnSOD可能在对抗线粒体氧化损伤过程中发挥了重要作用。

E2通过受体发挥其生物学效用，在各种不同细胞上对ER的上调或下调作用［14，15］。ISR是中药植物雌激素，已有报道ISR可使人乳腺癌T47D细胞的ERα mRNA表达显著增加，同时也可使ERβ mRNA表达增加［14］。本研究表明:E2、ISR能上调经 H2O2处理的HLECs的ER表达，并呈明显的浓度依赖关系，提示E2、ISR可能通过上调经H2O2处理HLECs的ER表达来发挥抗氧化损伤作用，从而起到防治老年性白内障的作用。该结果将为开发防治老年性白内障的有效药物提供科学的实验依据。

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