水通道蛋白4、7、8基因mRNA在新生鼠小肠结肠炎模型中的表达

李 松，崔其亮

（1.广东省东莞市石龙人民医院，广东东莞 523326；2.广州医学院第三附属医院，广东广州 510000）

新生儿坏死性小肠结肠炎（neonatal necrotizing enterocolitis，NEC）是新生儿尤其是早产儿胃肠道的一种严重、需要急救治疗的疾病，病死率为10%～50%[1]。NEC在发病过程中出现胃肠功能紊乱，引发水电解质代谢障碍是该病的重要表现之一。水通道蛋白（AQPs）是一组构成水通道与水通透性有关的细胞膜转运蛋白，广泛存在于动物、植物及生物界，它们的发现起始于Agre-P[2]。在消化道，AQPs在肠上皮细胞顶端质膜表达对水通透性起重要作用，并证实与多种疾病发病有关，但NEC发病过程中出现的水代谢障碍是否与AQPs表达变化有关，国内外相关报道较少。本文通过建立NEC鼠模，用荧光定量技术揭示NEC发病过程中出现的水代谢障碍与AQPs之间的关系。

1 材料与方法

1.1 实验动物

封闭群新生1日龄SD大鼠，雌雄不限，体重8～10 g，由广东省实验动物中心提供。与母鼠同笼，母鼠喂养。母鼠自由饮水，喂以条杆状动物饮料，室温15～25℃，自然采光。

1.2 主要仪器及试剂

Mx-3000P荧光定量仪（美国Stratagene公司）；自制有机玻璃常压低氧舱大小为5 L的广口瓶，气孔和出气孔各1个；CY-7指针式测氧仪（成都贝斯达仪器有限公司）；总RNA提取试剂盒（美国Promega公司）；逆转录PCR试剂盒[Takara宝生物工程（大连）有限公司]；PCR反应试剂盒（SYBR GreenⅠ）[Takara宝生物工程（大连）有限公司]。

1.3 实验方法及步骤

1.3.1 实验动物及分组

1日龄SD大鼠共20只，体重8～10 g，分为实验组（n=10）与对照组（n=10）。实验组依照“1.3.2”项下方法暴露在低氧条件下，4 d后断头处死，对照组为空气。

1.3.2 动物模型的制作[3]

先给低氧舱通入99.99%CO2，调节流速，应用CY-7指针式测氧仪，测得舱内的CO2浓度达99%后，放入1日龄新生SD大鼠5 min后取出，迅速向舱内通入99%O2，应用测氧仪使舱内氧浓度达99%，再将低氧后新生鼠放入舱内5 min取出。经处理后所有新生鼠均放回母鼠身边喂养，至第4天断头处死，用眼科剪行剖腹术取出十二指肠下端至直肠上端的肠道组织，-70℃冻存。

1.3.3 染料法（SYBR GreenⅠ法）荧光定量PCR反应

1.3.3.1 鼠肠组织总RNA提取 总RNA提取试剂盒由Promega公司提供，按照操作说明上的SV Total RNA Isolation System步骤进行总RNA提取，并经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，紫外分光光度计测定A260和A280确定RNA质量。28s rRNA条带强烈且A260/280位于1.8～2.0之间的RNA样品用于后续实验。

1.3.3.2 逆转录反应 逆转录反应使用Takara试剂盒进行，取总 RNA 4.0 μl，依次加入 5× Prime ScriptTMBuffer 2 μl，Prime ScriptTMRT Enzyme Mix 0.5 μl，Oligo dT Primer 0.5 μl，Random primers 0.5 μl， 加无 RNase 水补足配成总体积 10 μl的反应液，37℃ 15 min（逆转录反应），85℃ 5 s（逆转录酶的失活反应），合成好的cDNA放入-20℃冰箱保存备用。

1.3.3.3 引物的合成 荧光定量RT-PCR所用的AQP4、7、8和β-actin引物由Takara公司合成，PAGE纯化级别。引物序列如下：β-actin，F 5'-GGA GAT TAC TGC CCT GGC TCC TA-3'，R 5'-GAC TCA TCG TAC TCC TGC TTG CTG-3'，第 1026～1175位核苷酸，片段长 150 bp；AQP4，F 5'-AGC CAC GGG CGT ATT CTG AG-3'，R 5'-CGC CTT GGT TCT GTA GGT TCT GA-3'，第 2615～2731 位核苷酸，片段长 117 bp；AQP7，F 5'-TTC CTG GCG GAG TTC CTG AG-3'，R 5'-TGC CAC ATG TAT TCC CAT GGT C-3'，第 322～468 位核苷酸，片段长147 bp；AQP8，F 5'-CGG TCA TCG AGA ACA GTC CAA ATA-3'，R 5'-GCG ACA CAG CAG GGT TGA AG-3'， 第292～417位核苷酸，片段长126 bp。

1.3.3.4 荧光定量PCR反应 以β-actin作为内参基因，采用SYBR GreenⅠ染料法进行PCR反应扩增，在测定目的基因的同时测定内参基因用以标准化标本。反应体系：RT反应液2 μl，加 SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μl， 上下游引物各 0.5 μl，加dH2O补足至25 μl总体系。各取样品3 μl，使用EASY Dilution按 10 倍梯度稀释 4 次（1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000），每个浓度各取2 μl，行3个复孔进行PCR反应，制作标准曲线。由于采用相对定量法作比较，标准曲线的横坐标并不要求真实的起始模板拷贝数，故制作标准曲线的时候需要设定模板的相对拷贝数。上述5个梯度的样品对应设定的相对拷贝数分别为5×107copies/μl、5×106copies/μl、5×105copies/μl、5×104copies/μl、5×103copies/μl。 反应条件如下：95℃ 10 s 预变性，95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环PCR反应。Mx-3000P荧光PCR仪自动读出待检样品Ct值。另外以样品中起始模板的拷贝数为横坐标，Ct值为纵坐标，并以上述配制的按10倍梯度稀释的样品为5个点，绘制出标准曲线，自动计算出曲线的斜率（slope）及扩增效率（E）。

1.4 统计学处理

2 结果

对照组 AQP4、7、8 基因的平均 Ct值分别为（18.84±0.43）、（19.80±0.43）和（20.68±0.31）。 实验组 AQP4、7、8 基因的平均Ct值分别为（21.85±0.45）、（22.62±0.24）和（23.51±0.20）。对照组 β-actin 基因的平均 Ct值为（15.40±0.31），实验组 β-actin基因的平均 Ct值为（15.30±0.49）。

图1～4中各条线分别表示 β-actin、AQP4、AQP7和 AQP8标准曲线，横坐标代表相对模板浓度，纵坐标代表Ct值，5个梯度稀释点基本在一条直线上，证明Ct值与相对拷贝数据呈良好的线性关系。荧光定量仪分析软件求得标准曲线方程Y=aX＋b，X代表起始模板拷贝数，Y代表Ct值，这样通过标准曲线中方程可求出待检样品的相对拷贝数。见表1。

图1 β-actin标准曲线

图2 AQP4标准曲线

图3 AQP7标准曲线

图4 AQP8标准曲线

表1 荧光定量RT-PCR测定各基因mRNA的相对表达量（）

表1 荧光定量RT-PCR测定各基因mRNA的相对表达量（）

用Pfaffl[4]推导的数学公式计算目的基因的相对表达量：

Ratio（R）表示目的基因在样品与对照品间表达差异的倍数，分子部分为目的基因扩增效率，分母部分为内参基因的扩增效率。△Cttarget（control－sample）表示对照组与实验组中目的基因的 Ct值之差，△Ctref（control－sample）表示对照组与实验组中内参基因的Ct值之差。Etarget和Ereference分别表示目的基因和内参基因的扩增效率。如果目的基因与内参基因的扩增效率都接近100%且相差<5%，也可以将PCR扩增效率默认为100%，这样公式就简化为2-△△Ct，计算结果为R值。R<1表示基因表达下降，R>1表示基因表达上升。

采用Pfaffl等[5]设计的 REST-2005软件运行 2-△△Ct公式，计算R值。把所有荧光定量资料包括各实验组Ct值、对照组Ct值、模板Ct值和模板浓度倍数输入计算机，运行软件，软件自动计算R值及P值。

根据REST-2005软件计算结果，内参β-actin基因的R值为（1.000±1.079）。 AQP4、7、8 基因与内参 β-actin 基因比较，实验组表达下降，R 值分别为（0.117±0.129）（P<0.05）、（0.140±0.156）（P<0.05）和（0.134±0.140）（P<0.05）。 实验组 R<1，与对照组比较，有显著性差异（P<0.05）。用REST-2005软件计算各基因组QPCR反应的反应效率（E）、相对表达差异倍数（R）、样本标准误（SE）、95%可信区间（95%CI）及 P 值。结果见表2。

表2 各基因组QRT-PCR反应结果比较

3 讨论

目前对AQPs的研究逐渐深入，发现AQPs参与多种消化道疾病的发病过程。主要集中在AQP1～8等几种。研究发现，AQPs与口干症[6]、便秘及大肠内液转运有关[7]。Ma等[8]在AQP5的剔除实验中发现，剔除AQP5基因的大鼠经毛果芸香碱刺激后其唾液分泌量减少60%以上，而剔除AQP1基因及AQP4基因的大鼠唾液分泌量并未见明显减少，说明AQP5在涎腺的分泌中扮演着关键的作用。血管活性肠肽（VIP）神经元广泛分布于回结肠壁内，其递质VIP抑制肠道蠕动，参与便秘的发生。AQPs是VIP作用的最终靶分子之一，VIP能过cAMP依赖的途径上调AQP3及其mRNA的表达[9]，可以推测VIP参与便秘发生与上调AQPs的表达，从而促进水分的吸收有关。

小肠大部分切除后出现的腹泻病，可能与AQPs上调有关。Tsujikawa等[10]研究SD大鼠小肠被大部分切除后AQPs mRNA在残留小肠、回肠、结肠中表达的变化，他们选取6周龄SD大鼠（n=15），切除80%远端小肠，残留的小肠、回肠、结肠分别在术后第1、3、5、7天切开，提取残留肠黏膜组织，用Northernblot技术分析AQPs mRNA的表达。结果发现，残留小肠AQP1和AQP3 mRNA在术后1 d表达明显增加，AQP7 mRNA在术后3 d增加，AQP4 mRNA术后无变化；结肠AQP3 mRNA在术后第1、7天表达增加，AQP4 mRNA无改变；AQP8 mRNA表达在术后第7天轻微增加，表明小肠大部分切除后除AQP4外，多种AQPs适应性上调。

Hardin等[11]用硫酸钠葡聚糖（DSS）喂养小鼠制成结肠炎模型，在进食DSS后12 h～7 d，以及从停止进食DSS后的恢复阶段第1天至第15天进行AQPs作用评价，并在实验阶段前3 d对鼠肠水分吸收进行测量。结果显示，DSS组12～24 h后结肠AQP4、7、8表达开始减少并持续至第7天，停止进食DDS后逐渐恢复，且病变肠组织对水分的吸收减弱。从结肠炎、溃疡性结肠炎及感染性结肠炎患者中提取的病理标本发现相似的改变。

新生儿时期严重的肠道疾病NEC虽然病因与成人结肠炎有很大不同，但从病理角度来看有非常相似的病理改变。各种原因引起的肠壁缺血、低氧被认为是发病的直接因素，特别在新生儿时期，窒息、低氧、休克等原因引起机体防御性反射，肠壁血流减少、缺血，肠黏膜屏障损伤情况容易发生。为了探讨AQPs在其中所起到的病理作用，本研究制作鼠模型进行前期研究。

NEC鼠模是采用新生SD大鼠，模拟宫内低氧环境下制作而成，用高纯度CO2在短时间内使鼠窒息，再通入高纯度O2复苏，造成肠道微循环缺血-再灌注损伤的病理过程。受损的肠组织通过荧光定量实验证明，与空白组比较，AQP4、7、8 mRNA在NEC组表达下降，实验仅说明AQPs在NEC鼠模中的表达改变，不能直接说明这些基因在发病中的调节机制。Laforenza等[12]认为APQs能起到使水跨细胞吸收或分泌的作用。肠功能出现障碍后，AQPs表达下降，可能与其蛋白质构象改变或发生移位有关。肠道的消化和吸收功能丧失，肠液大量排出，造成脱水肠液排进第三间隙及腹腔，造成体液丢失，引起内环境紊乱，AQPs的表达变化可能起到维持体液平衡及内环境稳定的作用。

AQPs与NEC的发病关系主要涉及肠腔渗透压的改变。NEC发病过程出现的水代谢障碍可能与AQPs的表达发生变化并引起肠腔渗透压改变有关。由以上可知，水吸收的主要器官是消化道。AQPs表达的变化可以影响水的吸收，使机体出现水代谢障碍，本实验NEC鼠模从外观上分析有脱水的表现。NEC鼠模实验证明AQPs表达下降，提示发生NEC病变时可引起细胞信号改变，导致AQPs合成障碍，从而形成NEC发病机制中的一个因素。目前AQPs在细胞内信号调节机制下出现的表达变化，在肾脏、肝脏已有很多学者阐述清楚，但在消化道方面仍然需要进一步研究。

AQPs参与消化道疾病是可能的，但发病机制较复杂。由于NEC是一种多因素引起的疾病，除AQPs外，还涉及其他如细胞因子、血管内皮素、血小板活性因子等参与发病过程。实验的最终目的是揭示真相，为临床打下基础。希望通过本次实验使相关工作者对AQPs给予足够的重视，认识到AQPs受损是一个引起机体水代谢紊乱的危险因素。

本实验建立鼠模采用荧光定量方法探讨AQPs在消化道中的作用还有许多不完善的地方。首先，NEC是一种多因素引起的疾病，在该鼠模型不能完全反映出来；其次，对于AQPs与病因的联系仍然认识不够，不能认为AQPs受损直接导致NEC的发生。目前仍未发现AQPs与NEC发病的直接联系。目前已有大量的前期工作从动物实验、病理生理、分子生物学、基因表达等角度研究AQPs在机体内的表达及作用机制，这些基础研究最终将应用到临床，为解决疾病与健康问题提供理论依据。

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