箬竹提取物抑菌活性研究

张 慧，林海萍，盛恩浩，厉 亮，胡树恒，毛胜凤*

（1. 浙江省临安市林业科学研究所，浙江 临安 311300；2. 浙江农林大学，浙江 临安 311300；3. 浙江省临安市林业局，浙江 临安 311300；4. 浙江省临安市昌化林业站，浙江 临安 311300；）

随着人们生活水平的不断提高，对食品提出了更高的要求，食品工业因此获得了迅猛的发展。食品工业的关键问题之一是防腐保鲜，延长保存期，添加防腐剂是其重要措施之一。天然食品防腐剂作为一类新型安全高效的防腐剂，已成为食品科学研究的热点之一，随着生物技术的不断发展，利用动物、植物、微生物或其代谢产物等为原料，经提取、酶法转化或者发酵等技术生产的天然抗菌物质会越来越多[1～2]。天然食品防腐剂也是今后防腐剂市场的主要方向。

竹叶在我国具有悠久的药用和食用历史，是中医一味著名的清热解毒药[3]。最新的研究结果表明，竹叶中含有大量的黄酮类化合物和生物活性多糖等有效成分，其中的酚酸类化合物、蒽醌类化合物、萜类内酯和生物碱等都有着较强的抑菌杀菌作用[4]。国内外竹叶系列产品已上市，将其制成片状、粉剂、胶囊以及饮料等降血脂、抗疲劳、调节免疫力、清热解毒、抗菌防癌等药品、功能性食品及食品添加剂[5]。竹叶是一种比银杏叶资源量大而廉价的林业资源，前景广阔，但目前应用较少，有待进一步开发利用。

本研究以箬竹（Indocalamus tessellatus）叶水提取物和丙酮提取物对大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、八叠球菌（Sarcina）、黑曲霉（Aspergillus niger）、青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）的抑菌活性进行研究，现总结如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、八叠球菌、黑曲霉、青霉、木霉菌种均来自浙江农林大学林业与生物技术学院森林保护实验室。

1.1.2 主要仪器 JASON-1型真空泵（美国GAST）；303A-4型数显电热培养箱（南京大冉科技有限公司）；DKZ-1型电热恒温振荡水槽（上海楚柏实验室设备有限公司）；EYELA旋转蒸发仪N-1001S型（日本Eyela）；FA1004型电子天平（南京东迈科技仪器有限公司）；FK-A组织捣碎机（金坛市晶玻实验仪器厂）。

1.1.3 主要试剂 牛肉膏（分析纯）、蛋白胨（分析纯）、氯化钠（分析纯）、蔗糖（分析纯）、琼脂条（食品级）、丙酮（分析纯）、盐酸(分析纯)、氢氧化钠（分析纯）、蒸馏水（实验室自制）等。

1.1.4 培养基

1.1.4.1 细菌培养基

细菌培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基。

制作方法：在锅内加水1000 mL，放入牛肉膏3 g、蛋白胨10 g和氯化钠5 g，放在电炉上加热。待烧杯内各组分溶解后，加入琼脂15 g，不断搅拌以免粘底。等琼脂完全溶解后补足失水，用1 mol/L盐酸或1 mol/L的氢氧化钠调整pH值到7.2 ～ 7.6，分装于不同试管，加棉花塞，用高压蒸汽灭菌30 min，冷却后贮存备用。

1.1.4.2 霉菌培养基

霉菌培养基：PDA培养基。

制作方法：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸0.5 h，纱布过滤，再加10 ～ 20 g葡萄糖和17 ～ 20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，所得滤液分装于不同试管，加棉花塞，高压蒸汽灭菌20 min后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。

1.2 实验方法

实验流程：新鲜竹叶→组织捣碎机捣碎→加入丙酮或水→常温浸泡48 h→旋转蒸发仪浓缩→溶剂再提取→浓缩液（竹叶防腐剂）。

竹叶丙酮提取液制备：取5 kg的箬竹叶，洗净晾干用捣碎机捣碎，盛于不锈钢桶中，加入丙酮（20 L），浸泡48 h得竹叶原提取液。过滤提取液后用旋转蒸发仪浓缩提取液，提取温度控制在38 ～ 48 ℃，然后再用丙酮溶剂提取1次，得实验用原液。

竹叶水提取液制备：取5 kg的箬竹叶，洗净晾干后用捣碎机捣碎，盛于不锈钢桶中，加入蒸馏水（20 L），浸泡48 h得竹叶原提取液。过滤提取液后用旋转蒸发仪浓缩提取液，提取时温度控制在50 ～ 60 ℃，再用蒸馏水提取1次，得实验用原液。

1.3 抑菌试验

1.3.1 抑菌圈试验 抗菌试验采用滤纸片法，操作步骤如下：

1.3.1.1 菌悬液的制备 试验菌从 4 ℃冰箱中取出后，接种在新鲜斜面培养基上，细菌（大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、八叠球菌）经37℃、24 h，霉菌（黑曲霉、木霉、青霉）经28 ℃、24 h恒温培养活化后，用无菌生理盐水制备菌原液。吸取l.00 mL菌原液加入9.00 mL无菌生理盐水中，得到稀释10倍的菌悬液，依次进行梯度稀释。将不同稀释度的菌悬液各吸取0.20 mL分别加入到已灭菌冷却的各自适宜的平板培养基表面，涂布均匀。按上述条件培养，根据观察结果，选取各自适宜的菌液浓度，要求在该浓度下，菌能长满整个培养皿且分布均匀。

1.3.1.2 滤纸片的制备 用打孔器将102型新华滤纸制成直径为5 mm的圆片，放入干燥洁净的试管内，经121℃热灭菌30 min，浸入各提取液及相应的提取溶剂中，1 h后取出，无菌条件下晾干备用。

1.3.1.3 抑菌活性测定[6]对细菌，用无菌吸管吸取各自适宜浓度的菌悬液0.2 mL加在已倒好的平板培养基表面，涂布均匀；对霉菌，用无菌棉签蘸取霉菌孢子悬液，均匀地涂布在已倒好的平板培养基表面。用无菌镊子夹取已制备好的滤纸片，放到上述含菌平皿上，每皿3片，细菌经37℃、24 h，霉菌经28℃，48 h培养后，量取抑菌圈直径，以抑菌圈直径作为竹叶抑菌活性指标，直径越大抗菌活性越强。

对照组制备：在已涂布好菌液的培养基上放上消毒好的滤纸片，作为空白对照组，每皿对照3片；将消毒过的滤纸片用丙酮处理，放在已涂布好菌液的培养基上，每皿3片作为丙酮培养基。

1.3.2 最小抑制浓度（MIC）试验 用两倍稀释法将竹叶防腐剂稀释成不同浓度，在各平皿中分别加入2 mL稀释液和20 mL已熔化的培养基，充分混匀。冷却凝固后，加入0.2 mL上述菌悬液，涂匀，培养。观察结果，以不长菌的竹叶防腐剂的最低浓度为最小抑制浓度（MIC）[7]。

1.3.3 竹叶防腐剂的食物防腐试验 将不同浓度竹叶抽提液作为抑菌剂加入果品及豆腐干中，自然条件下放置。隔天检查果品的保存情况，查看是否有变质情况；每天对处理过的豆腐干进行检查，做出感官评价。

2 结果与分析

2.1 抑菌圈测定结果

由表1可以看出，箬竹竹叶提取物对细菌都有一定的抑菌效果。箬竹丙酮提取物对大肠杆菌的抑菌效果最好，抑菌圈直径达到12 mm，相对于试剂对照组也大4 mm多，水提物的抑菌圈直径也达到了10 mm，说明竹叶提取物对大肠杆菌的抑菌效果是比较明显的，且受不同试剂提取的影响较小。枯草芽孢杆菌和八叠球菌的丙酮提取物相对于对照组抑菌圈都只大了1 mm左右，但水提物对八叠球菌的抑制作用则很明显，达到了20 mm左右，说明不同提取试剂对其影响较大。两种提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径都在9 ～ 10 mm，说明该菌对提取试剂的影响较小。霉菌的抑菌圈大小变化不大，说明提取液对霉菌的抑菌效果与提取试剂的关系不大。

从两种提取液的对这几种菌的抑菌效果试验的结果可以得出，菌种不同，提取液不同，抑菌效果也有比较大的差异。

表1 箬竹丙酮、水提取物抑菌效果Table 1 Antibacterial effect of Acetone and water extracts of antibacterial of In. tessellates mm

2.2 最小抑制浓度

将浓缩物按2倍稀释法稀释，得到表2最小抑制浓度数据，其中大肠杆菌的两种提取液都是稀释到浓缩液的 0.781%得到最小抑菌浓度，其他几种细菌的两种提取物都差不多，最小抑制浓度都不超过浓缩液的3.125%，表明箬竹叶的提取物在比较低的浓度下能抑制一些常见食品腐败细菌。由几种霉菌的测试结果表明提取物对霉菌的最小抑制浓度要高于细菌，并且水提物的最小抑菌浓度普遍高于丙酮提取物，说明丙酮作为提取试剂要比水的效果好很多，但是从成本和安全考虑水要廉价和安全许多。

表2 最小抑制浓度（浓缩液＝100%）Table 2 Minimum inhibitory concentration(concentrated liquid = 100%) %

2.3 食物防腐试验

由表3可知，对苹果的保鲜效果最好，箬竹提取物处理比自然放置时间长了一倍；香蕉的保存时间比较短，只比对照组多几天；葡萄的保存时间水提物比对照组时间长了一倍，丙酮提取物只长了3 d；橘子的保存时间2种提取物处理差不多，都比原始放置下长了10 d左右。

将豆腐干经过水、丙酮、箬竹的丙酮提取物和水提取物处理后放在20℃下保存，每天对其作感官评价，结果如表4所示。

表3 提取物对果品的保鲜时间Table 3 Preservation time for fruit of extracts d

表4 提取物对豆腐干的保鲜感官评价Table 5 Sensory evaluation on dried Doufu kept by extract

由表4可知，两种提取物对豆腐干的保鲜效果都很明显，并且丙酮提取物的保鲜效果比水提取物要好。相对于贝壳煅烧物处理的豆腐干的防腐作用，竹叶提取物处理的抑菌时间更长，对食品的腐败变质的抑制效果更好[8]。

3 结论与讨论

（1）箬竹叶提取物对霉菌的抑制作用不是很好，对木霉的抑制作用最差。丙酮提取物对大肠杆菌、水提物对八叠球菌的抑制作用最好。

（2）使用竹叶提取液对几种菌的最小抑制浓度的试验表明，相比其他防腐剂其用量少而效果好。

（3）竹叶成分复杂，其抗菌成分及抗菌机制有待进一步研究。一般认为竹叶防腐成分可能是对苯二醌及其衍生物、多糖类、黄酮及其酚类[9]。

（4）在果品应用上竹叶提取物有较好的防腐保鲜作用，这为竹叶防腐剂的开发应用提供了实验依据。特别是对于一些热敏性食品，由于其在高温高压下杀菌易导致食品品质、风味、营养等的严重破坏，可通过在其中加入竹叶提取液，避免高温高压处理，达到既防腐又保证食品品质、风味与营养的效果。

（5）目前在竹叶防腐剂提取方法上还有待更好的完善，寻找一种更简便高效，且成本低廉的提取方法将为竹叶防腐剂的开发提供更为有利的条件。

[1]Cao Haiqun，Yue Yong-de，Peng Zhenhua，et al. Evaluation of Extracts from Bamboo for Biological Activity Against Culex pipiens pallens [J].Insect Sci，2004，11（4）：267－273.

[2]Giesova M, Chumchalova J, Ploclova M. Effect of food preservatives on the inhibitory activity of acidocin CH5 and bacteriocin D10[J ]. Eur Food Res Technol，2004，218（2）：194－197.

[3]杨抚林，邓放明，黄群，等. 竹叶提取物中功能性成分及效用[J]. 中国食物与营养，2004（5）：53－55.

[4]吴传茂，吴周和，曾莹. 从植物中提取天然防腐剂的研究[J]. 食品科学，2000（9）：24－27.

[5]许钢，张虹，俞国科. 竹叶提取物抑菌效果探讨[J]. 山西食品工业，2000（3）：21－23.

[6]黄文，王益，胡筱波，等. 竹叶提取物抑菌特性的研究[J]. 林产化学与工业，2002，22（1）：68－70.

[7]谢碧霞，陆志科. 提取条件对竹叶提取率与抑菌效果的影响[J]. 经济林研究，2004，22（3）：5－8.

[8]段杉，陈海梅，林秋峰，等. 贝壳煅烧物的防腐作用研究[J]. 中国食品添加剂，2007（6）：74－78.

[9]杨校生. 国内外竹子化学利用及其研究概况（续）[J]. 世界林业，1997（7）：34－35.