通直型巨龙竹不同地理种源遗传分化的ISSR分析

杨汉奇，阮桢媛，田 波，杨宇明，孙茂盛

（1.中国林业科学研究院 资源昆虫研究所，云南 昆明 650224；2.西南林学院 资源学院，云南 昆明 650224；3.中国科学院 西双版纳热带植物园 昆明分部，云南 昆明650223）

巨龙竹Dendrocalamus sinicus是目前世界上已知最高大的竹种，竹秆高为25～35 m，胸径为20～30 cm，平均质量为100～150 kg·株-1，多用于竹建筑、竹纸浆等原材料，是中国南部热区发展竹产业和生态环境建设中具极大发展潜力的优良经济竹种之一［1］。巨龙竹自然分布仅限于云南西南部和南部局部海拔1 800 m以下的山谷和坝区。最近的调查发现，巨龙竹核心分布区为云南西南部阿佤山地区，而且秆形通直粗大，并且充分体现了当地以佤族为主的民族竹文化，具有显著的民族文化保护价值；而云南南部分布区种群少，秆形多弯曲，不适合于生产竹材［2］。由于巨龙竹分布狭域，种源稀少，自然结实率极低，目前无性繁殖苗木困难，亟需开展相关的保护生物学研究工作［2］；另一方面，近年来通直型巨龙竹已经在云南其他热区被较大规模的引种栽培，但忽视了种源的选优和遗传品质的鉴定，使得巨龙竹的推广栽培面临着潜在的风险。简单序列重复区间扩增（ISSR，inter-simple sequence repeat）分子标记是Zietkiewicz等在简单序列重复标记（SSR，simple sequence repeat）技术基础上发展的一种新的微卫星分子标记技术［3］，同SSR等其他分子标记相比，ISSR技术具有灵敏性高，费用低，实验难度低等优点，已经成为目前遗传多样性分析中最常用的技术手段之一，在遗传图谱构建［4］、遗传多样性分析［5］和种质资源鉴定［6］等方面得到广泛应用。最近，ISSR技术也开始应用于竹子遗传多样性方面的研究，Lin等［7］利用ISSR技术发现毛竹Phyllostachys pubescens 10个栽培变型间具有很高的遗传相似性。本研究旨在利用ISSR分子标记研究巨龙竹核心分布区内不同地理种源间的遗传分化水平，为保护这一珍贵的竹子种质资源以及扩大栽培和利用提供基础研究资料。

1 材料与方法

1.1 材料

选择云南西南部巨龙竹核心分布区内不同海拔、地理距离较远且有代表性的4个通直型近天然种群（表1），采集幼嫩枝叶作为试验材料，每个采样点根据巨龙竹的分布情况随机采样，每丛至少相距50 m。

表1 用于ISSR分析的4个巨龙竹居群Table 1 Populations of Dendrocalamus sinicus for ISSR analysis

1.2 总DNA提取

采集生长良好无病虫害感染的幼嫩枝叶并用硅胶保存，参照十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法［8］提取总DNA；DNA浓度和纯度用分光光度计检测。

1.3 引物筛选与聚合酶链式反应（PCR）扩增反应

所用引物系列为加拿大哥伦比亚大学UBC公司公布的第 9套 ISSR引物序列（http：//www.biotech.ubc.ca/services/NAPS/Primer_Sets/Primers.pdf），由上海生工合成。引物筛选时每个居群随机挑选2个模板在25 μL的反应体系中进行扩增筛选，从其中80个引物中选取7个扩增条带清晰、重复性好的引物（表2）用于全部4个居群样本分析。

表2 ISSR引物序号与序列Table 2 The ISSR primers

PCR（polymerase chain reaction）反应在 ABI Verity梯度PCR仪上进行。25.0 μL反应体系包括：10×buffer（100 mmol·L-1三羧甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）（pH 8.8）； 500 mmol·L-1氯化钾（KCl）2.5 μL，5 mkat·L-1的 Taq DNA 聚合酶（fermentas）0.5 μL，25 mmol·L-1的氯化镁（MgCl2）1.8 μL，10 mmol·L-1的三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）（Takara，宝生物工程大连有限公司） 2.5 μL，10 μmol·L-1的引物（上海生工生物工程有限公司）1.5 μL，二甲基亚砜（DMSO）0.5 μL，50 mg·L-1的模板 DNA 0.7 μL，以及重蒸水（ddH2O）15.0 μL。

扩增程序：94℃，5 min，1个循环；94℃，45 s，53～55°C（温度依引物不同而改变），1 min，72℃，2 min，40个循环；72℃，7 min，1个循环。

1.4 PCR产物的凝胶电泳

PCR 扩增产物在 16.0 mg·L-1的琼脂糖凝胶上电泳［0.5×TBE（Tris-硼酸），5 V·cm-1］分离，以 100 bp DNA Ladder Marker（100～3 000 bp）（fermentas）作标记估算扩增片断大小，溴化乙锭（EB）染色后在凝胶成像系统（UPV）上显像，观察并记录。

1.5 数据分析

电泳图谱中每一扩增条带代表引物的一对结合位点且视为有效的分子标记。同一引物的扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性，依据ISSR标记判读电泳图谱中扩增产物的有无及其分子量大小，将电泳图谱中清晰的条带记作“1”，否则记作“0”，建立0/1数据矩阵［9－10］。应用POPGENE 1.32［11］软件计算多态性位点百分比，Nei’s基因多样性指数（H），Shannon多态性信息指数（I），基因分化系数（Gst），基因流（Nm），Nei’s遗传距离和遗传一致度，并据此用算术平均非加权配组法（UPGMA）进行聚类，分析各群体之间的遗传关系。

2 结果与分析

2.1 DNA提取结果

提取的4个种群的巨龙竹总DNA的吸光度D260/D280比值为1.6～2.0，显示DNA样品纯度高。利用8.0 mg·L-1脂糖检测提取的DNA浓度及纯度，结果显示DNA条带清晰，没有核糖核酸（RNA）污染，浓度合适（图1），适合用于ISSR标记技术分析。

图1 巨龙竹孟连居群部分样品总DNA电泳检测图Figure 1 The agarose electrophoretogram of Dendrocalamus sinicus total DNA extracted form samples of Menglian population

2.2 引物扩增结果

优选的7个条带清晰、稳定性高且相对较多条带的引物用于全部样品的PCR扩增，各引物扩增的条带数如表2，部分引物的扩增结果如图2和图3。

图2 引物857对ML居群样品的扩增样式Figure 2 ISSR bands of Menglian population samples amplified with primer 857

图3 引物810对CY居群样品的扩增样式Figure 3 ISSR bands of Cangyuan population samples amplified with primer 810

2.3 遗传多样性和遗传分化分析

在检测到的所有清晰且重复性好的73个有效位点中有54个多态位点；在物种水平上，多态位点百分率为73.97%，Nei’s基因多样性指数（H）和Shannon信息指数（I）分别为0.260 0和0.3921。从各个居群来看，西盟居群多态位点百分率（2.74%）最低，而孟连居群多态位点百分率（21.92%）最高，勐海居群和沧源居群的处于中等水平（表3）。居群间的遗传分化系数（Gst）达0.863 4，表明在物种水平上，有13.66%的遗传变异存在于居群内，而86.34%的遗传变异存在于居群间，居群之间表现出较高水平的遗传分化。居群间的基因流（Nm）仅为0.079 1。

表3 巨龙竹居群内的遗传多样性Table 3 Genetic variation in natural populations of Dendrocalamus sinicus

2.4 遗传距离与聚类分析

根据Nei’s遗传距离和遗传一致度，用NTSYS-PC V2.11C软件对4个居群进行非加权配对算术平均法（UPGMA，unweighted pair group method with arithmetic mean）聚类分析的结果见图4：4个巨龙竹居群聚为一支；Nei’s遗传距离（表4）显示西盟居群和孟连居群的遗传距离最远，为0.572 6，勐海居群和沧源居群的遗传距离最近，为0.247 0。

图4 巨龙竹居群间Nei’s遗传距离的UPGMA聚类图Figure 4 UPGMA dendrogram for 4 Dendrocalamus sinicus populations based on Nei’s genetic distance

表4 巨龙竹的Nei’s遗传一致度（对角线上方）和遗传距离（对角线下方）Table 4 Nei’s original measures of genetic identity and genetic distance

3 结论与讨论

本研究中巨龙竹4个居群间的Nei’s基因分化系数（Gst）达到了0.863 4，表现出较高水平的遗传分化。Nybom总结了158份快速扩增多态DNA（RAPD），27份扩增片段长度多态性（AFLP）和13份ISSR植物材料的研究结果，其 Gst平均值分别为0.27，0.21和0.34［12］。与Nybom的结果比较，巨龙竹4个居群间表现出了遗传分化大的特点，这表明在推广栽培通直型巨龙竹的过程中，弄清种源的遗传品质是十分必要的。同时，由于通直型巨龙竹的遗传多样性丰富，不同居群间的遗传分化水平较高，因此，在其种质资源收集和保存时应该广泛地对其居群和竹丛加以充分的采样，以保持其丰富的遗传多样性。

植物居群间的遗传分化是其长期进化历史（如分布范围的改变、生境的片断化和居群的隔离等）、遗传漂变、繁育系统和基因流以及自然选择等因素综合作用的结果［13］。迄今为止，巨龙竹的进化历史还不清楚，但其生境片断化趋势较明显：巨龙竹自然分布区基本与云南热带季雨林区相吻合，而且仅限于滇西南和滇南局部地区，种群隔离明显；极端最低温度是影响巨龙竹分布的关键制约因素之一，它直接影响到巨龙竹能否越冬存活，在调查的4个地区中，西盟（－2.3℃）、孟连（－0.6℃）、勐海（－5.4℃）和沧源（－4.3℃）之间差异较大［2］。由于生境片断化和种群隔离效应的结果，使得种群内的变异程度降低，而种群间的遗传分化程度加大［14－15］。

繁育系统一般被认为是居群水平上影响遗传分化关键因素之一，对基因流动和选择等居群遗传参数影响较大［16-17］。木本竹子的繁育系统有着鲜明的特点：①竹类植物具有独特的开花习性，即一个生命周期只开1次花，开花周期长达几十年甚至上百年；1株开花后同一个种同一来源的所有克隆植株均陆续开花，开花后绝大多数植株将死亡；②在传粉生物学方面，竹子虽然是风媒传粉，但在野外多为零星开花，其花粉的传播也是有限的；而且大部分竹子花粉存在大量败育现象［18］。巨龙竹近年来在其分布区内经常观察到单丛零星开花［19］，由于雌雄异熟，加之其开花授粉时期多在雨季使得其授粉困难，导致结实率极低［20］。由于巨龙竹自然条件下有性繁殖能力极弱，不能实现种子的传播，影响其基因流的形成，导致其种群间个体迁移率小，基因流偏小（Nm为0.079 1），从而造成种群间遗传分化明显。

Wright认为群体间的基因流值若小于1，则遗传漂变可以导致居群间明显的遗传分化［21］。本研究调查的巨龙竹居群间基因流非常有限，显示遗传漂变对居群间遗传分化的影响较小。这可能是由于丛生竹类一般具有较强的无性繁殖能力，能在一定程度上降低小种群的遗传漂变，减轻了生境片断化的影响。

致谢：感谢审稿人提出的宝贵建议。

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