生防枯草芽孢杆菌B29菌株抗菌蛋白的质谱分析*

李 晶， 赵晓宇， 张先成， 王玉霞张淑梅， 张云湖， 孟利强

（1.黑龙江省科学院高技术研究院黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江省科学院微生物研究所，黑龙江哈尔滨150010）

近年生物质谱技术以其高效，快速及其自动化的特点，在蛋白质鉴定方面得到了广泛的应用。利用质谱技术，可以更精确地测定蛋白质的相对分子质量，而且获得的肽指纹图谱可以为蛋白质的性质提供更加准确的信息。

生防枯草芽孢杆菌可分泌多种特性不同的抗菌蛋白［1,2］。枯草芽孢杆菌B29菌株是一株具有广谱高效抗菌作用的生防细菌［3］，从该菌株发酵液中已分离纯化出一种具有抗菌活性的蛋白B29I［4］，对其进行质谱分析可进一步揭示该蛋白的性质，为以后的研究工作奠定基础。

1 实验方法

将纯化后的抗菌蛋白进行SDS-PAGE电泳，切下待测条带，放入装有无菌蒸馏水的1.5mL离心管中，交由军事医学科学院国家生物医学分析中心进行胶内酶切、肽段测序，以及肽指纹图谱的检索。

1.1 胶内酶解

将抗菌蛋白SDS-PAGE电泳条带在胶内进行酶解，具体步骤如下：

（1）用100μL 100mM碳酸氢铵溶液/50%乙腈脱色20min，丢弃上清液。重复该操作直至凝胶变为白色；

（2）加入60μL乙腈使凝胶脱水10min，丢弃上清液。将凝胶干燥后加入适量胰蛋白酶液。酶液用100mM碳酸氢铵溶液配制，浓度为12.5ng/μL。于4℃放置30min使凝胶完全泡胀；

（3）加约20μL 100mM碳酸氢铵溶液覆盖，于37℃保温12h，吸出上清液。凝胶用50μL0.1%甲酸/50%乙腈提取2次，每次15min。合并上清液及提取液后浓缩至约5μL以供质谱分析。

1.2 质谱（MALDI-TOF-MS）分析

酶解产物浓缩后用C18ZipTip（Millipore公司）脱盐：先用0.1%TFA/50%乙腈润湿填料并用0.1%TFA平衡，再将样品吸过ZipTip后用0.1%TFA反复冲洗，最后用10μL的0.1%TFA 33%乙腈洗脱。将2,5-二羟基苯甲酸（2,5-dihydroxybenzoic acid，DHB）溶于 1:3的乙腈/水溶液，配制成100mg/mL的溶液。先将0.5μLDHB溶液点在不锈钢MALDI样品板上，再将0.5μL样品溶液点在基质上使其混合并在室温下自然干燥。样品用配有o-MALDI（orthogonal MALDI）离子源的QSTAR Pulsar质谱仪检测。

1.3 蛋白数据库检索

登陆mascot网站，直接调用MALDI-TOF-MS得到的肽指纹图谱（.peaklist文件），进行检索。

2 结果与讨论

将聚丙烯酰胺凝胶电泳后的抗菌蛋白B29I样品带在胶内进行酶切后，对酶切产物进行MALDI-TOF-MS检测，得到肽质量指纹图（peptide mass fingerprinting,PMF），结果如图1所示。

图1 B29I酶切产物MALDI-TOF质谱图Fig.1 MALDI-TOP MS of antifungal protein B29I

将抗菌蛋白B29I的肽质量指纹图在Mascot数据库中进行检索，未得到有意义的结果，初步判定B29I为一种未被报道过的蛋白。将酶切产物经Q-TOF2检测，得到Q-TOF2质谱图，结果如图2所示。通过Q-TOF2检测，在B29I酶切产物中选取3个双电荷肽段，三个肽段质荷比分别为623.33、728.85和781.93。将这三个肽段经过诱导碰撞碎裂（collision-induced dissociation，CID）成为更小的碎片离子，测量这些碎片离子的质荷比和强度，获得串联质谱。质荷比为623.33的肽段序列为KTHVLEDEFK，相对分子质量为1244.64；质荷比为728.85的肽段序列为KGYQTGDFGAYLH，相对分子质量为1455.68；质荷比为781.93的肽段序列为RTYEVAEESPVLGL，相对分子质量为1561.82。

图2 B29I酶切产物Q-TOF2质谱图Fig.2 Q-TOF2 of antifungal protein B29I

3 结 论

通过对生防枯草芽孢杆菌B29菌株分泌的抗菌蛋白B29I进行质谱(MALDI-TOF-MS)分析，获得了抗菌蛋白B29I的肽指纹图谱，初步确定抗菌蛋白B29I为一种新蛋白。

［1］YLIU,ZCHEN,TBNG.Bacisubin,an Antifungal Protein with Ribonu clease and HemagglutinatingActivities fromBacillus subtilis Strain B-916［J］.Peptides,2007(28):553～559.

［2］谢栋,彭憬,王津红,等.枯草芽孢杆菌抗菌蛋白X98Ⅲ的纯化与性质［J］.微生物学报,1998,38(1):13～19.

［3］李晶,杨谦,张淑梅,等.枯草芽孢杆菌B29菌株防治黄瓜枯萎病的田间效果及安全性评价初报［J］.中国蔬菜,2009,2:30～33.

［4］LI JING,YANGQIAN,ZHAOLI-HUA,et al.Purification and charac terization ofa novel antifungal protein fromBacillus subtilis strain B29［J］.J.ZhejiangUniv.Sci.B.,2009,10(4):264～272.