丝素蛋白的相关生物学性能研究*

2010-07-16徐广涛林天送周新妹于海宁徐国文吴晓薇俞杭斌陈士票

天津医药 2010年9期

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近几年来，对蚕丝的应用研究已经从原来的纺织原料向医药、化妆品、食品和生化用品等领域延伸[1-3]。蚕丝柔软、强韧、光滑又富有弹性，一直以来都是用作传统的纺织材料，每年缫丝、织绸和服装等企业产生大量蚕丝下脚料，这些下脚料未得到充分有效开发利用，不仅污染环境，也造成极大浪费。笔者利用蚕丝下脚料提取丝素蛋白，进行相关生物学性能研究，探讨其综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂电子天平sps202F型（常州称重设备有限公司），分析天平AB204-N型（Mettler Toledo），紫外线分光光度计TU-1810（北京普析通用）。营养琼脂培养基：牛肉膏 3 g，酵母膏 3 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸馏水 1 000 mL。PDA培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 样品制备按文献[4]方法将丝素蛋白人工配制成丝素肽、350 nm丝素粉、3 μm丝素粉、大分子质量丝素肽和纳米丝素粉（<100 nm）。将上述丝素蛋白与50%二甲基亚砜液按体积比为1∶2.3混合，得到纳米丝素蛋白颗粒的混合液或悬浮液，反复离心脱水完全除去其中有机溶剂并进行超声处理，制成纳米丝素蛋白液。

1.2.2 抑菌活性测定（1）平板菌落计数法测菌落浓度。用3支1 mL无菌吸管分别精确地吸取10-5、10-6、10-7的稀释菌液0.2 mL，置于无菌培养皿中，在对照板中加入同体积的无菌生理盐水，后倒入热熔后的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约10～15 mL，迅速混匀，凝固后倒置于37℃温室中培养。培养24 h后，观察并取同一稀释度2个平皿上的菌落平均数进行计算：每毫升中总活菌数=同一稀释度2次重复的菌落平均数×稀释倍数×5。（2）贴板法测样品对霉菌的抑菌效果。用圆形玻璃管将长有霉菌的培养基取出，倒贴在含样品培养基和对照培养基上。分别观察48 h和72 h后的菌落生长状况。（3）液体培养法测样品对细菌的抑菌效果按文献[5]方法进行。样品溶液浓度为1.0 g/L，并采用等体积样品处理，对照组用牛肉膏蛋白胨培养基。每个试验组设试验区2个（分别接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌）。培养液37℃震荡培养24 h，测定各种样品在560 nm的吸光度值（A值），比较细菌生长情况。

1.2.3 抗紫外线活性的测定和研究配制0.1%的各样品溶液，在其未照射紫外线前进行200～400 nm的全波长扫描，得到各样品的吸收光谱。1 h后分别在最大吸收波长处测定其吸光度和200～400 nm处的吸收光谱，比较得出各样品吸收紫外线能力的变化。再分别配制1%和10%的各样品溶液，同上进行200～400 nm全波长扫描。

1.2.4 吸湿性和保湿性的测定用饱和碳酸钙溶液保持相对湿度，将5种样品分别置于密闭容器中，分别测量24 h和48 h后的质量（W1和W2），样品原始质量为W0。24 h吸湿率(%)=（W1-W0）/W0×100%，48 h 吸湿率 (%)=（W2-W0）/W0×100%。将吸湿48 h后样品（W2）置于干燥容器中，分别再测量24 h和48 h后的质量（W3和W4），计算24 h的保湿率(%)=［1-（W2－W3）/W2］×100%，48 h 保湿率(%)=［1-（W2－W4）/W2］×100%。

1.2.5 致敏性测定将各样品用50%二甲基亚砜溶解48 h，用蒸馏水稀释得到0.5 g/L的丝素蛋白液。抽取皮肤无损伤、无皮肤病白色雌性豚鼠18只（嘉兴学院医学实验中心），体质量（300±10）g。随机分为A组、B组和C组，每组6只。实验前24 h，对受试豚鼠进行脱毛处理，进行试验。（1）致敏接触：A组、B组和C组动物左侧脱毛区分别涂以0.5 mL的丝素蛋白液、50%二甲基亚砜和1%2,4-二硝基氯苯（DNCB），给药后用纱布和胶布固定，6 h后去除受试药物，观察0、24、48、72 h的过敏反应情况。第7天和第14天，用同样方法各重复1次。（2）激发接触：于末次给药(第14天)时A组、B组和C组动物右侧脱毛区分别涂以0.5 mL的丝素蛋白液、50%二甲基亚砜和1%DNCB。方法同上。（3）过敏反应平均分值和致敏率的计算。每只动物均按皮肤过敏反应评分标准评分，并计算各组的反应平均值，即反应平均值=（红斑形成总分+水肿形成总分）/合计动物数。计算受试药物的致敏率，即致敏率=出现皮肤过敏反应（无论程度轻重）阳性的动物数/受试动物总数。

2 结果

2.1 抑菌效果平板菌落计数法结果表明金黄色葡萄球菌菌落数最多，枯草芽孢杆菌菌落数最少，见表1。丝素蛋白液对霉菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有显著的抑菌效果。贴板法检测表明，48 h后对照培养基、含丝素肽、350 nm丝素粉、3 μm丝素粉、大分子质量丝素肽和纳米丝素粉样品的培养基中菌落大小分别为10 cm×10 cm、1.5 cm×1.5 cm、2.2 cm×1.4 cm、1.9 cm×1.5 cm、2.0 cm×1.7 cm、1.8 cm×1.5 cm。除350 nm丝素粉对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制效果相似外，其余丝素蛋白样品溶液对大肠杆菌的生长抑制效果优于对金黄色葡萄球菌的生长抑制效果，见表2。

表1 平板菌落计数法计算菌液

表2 液体培养法测定各样品560 nm下的吸光度值

2.2 丝素蛋白吸收紫外线活性测定结果 0.1%未照射紫外线的5种丝素蛋白样品对紫外线的最大吸收波长在200～230 nm。经紫外线照射1 h后，丝素肽、3 μm丝素粉、350 nm丝素粉吸收紫外线能力仍较强，见表3。1%和10%样品溶液的吸光度为负值，以丝素肽为例，浓度较高的溶液所产生的抗紫外线能力并非较好，见图1。纳米丝素粉吸收波长广，且经过10 min和20 min的紫外线照射后无明显变化，在短时间的稳定性较好，见图2、3。

表3 5种0.1%丝素蛋白液未照射紫外线时吸收波长和照射1 h后的吸光度

2.3 吸湿性和保湿性的测定结果大分子质量丝素肽和丝素肽的吸湿能力较其他的样品强，48 h吸湿率分别为44.78%和35.30%。就48 h保湿率而言，3 μm丝素粉和丝素肽更强，分别为82.29%和78.91%，见表 4。

2.4 丝素蛋白的致敏性测定 5种丝素蛋白样品经豚鼠皮肤致敏接触和激发接触实验，结果均为阴性，说明豚鼠皮肤对各丝素蛋白样品均无过敏反应，以大分子质量丝素肽为例说明见表5。

3 讨论

蚕丝蛋白包括丝素蛋白和丝胶蛋白2类。其中丝素蛋白与皮肤胶原蛋白同属结构蛋白，研究表明它具有良好的生物亲和性、无毒、无污染[6]。本研究结果表明，丝素蛋白液对霉菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均具有显著的抑菌效果，且对大肠杆菌的生长抑制效果明显优于对金黄色葡萄球菌的抑制效果。通过进一步的结构改进或者颗粒度研究，预计可以从中得到具有抗菌活性的新产品。