耐甲氧西林表皮葡萄球菌SCCmec分型特点及生物膜研究进展

李代清 丁 群

表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis，SE）是最常见的凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative staphylococcus，CoNS）。近年来，随着生物材料的广泛应用和免疫低下人群的增多，由SE造成的感染日趋严重，目前已成为医院感染的主要病原菌之一。SE分泌的毒力因子及胞外酶较金黄色葡萄球菌（staphylococcus auerus，SA）少，其致病机制主要与形成生物膜有关。通过与SA做对比，现将耐甲氧西林表皮葡萄球菌（methicillin-resistant S.epidermidis，MRSE）的葡萄球菌染色体 mec盒（staphylococcal chromosome cassette mec,SCCmec）基因型分子流行病学特点、生物膜形成过程、相关因子及基因调控等方面的研究进展做一综述。

1 MRSE的SCCmec基因型分子流行病学特点

MRSE发生率呈逐年升高趋势。我国一项涉及15个城市、17家医院的调查显示，82.89%的临床SE菌株对甲氧西林耐药[1]。SE通常比SA对抗生素的耐药性更强，但它们更多情况下仅在体内有植入医疗装置或免疫低下患者中引起感染[2]。甲氧西林耐药机制主要与mecA基因有关，它是一段编码低亲和力青霉素结合蛋白2α（PBP2α）的外源性DNA，以复合体的形式存在于可移动性SCCmec上。SCCmec由mec复合体和染色体盒重组复合体（ccr）两部分组成，根据mec和ccr同源性重组不同，可将SCCmec分为6型：其中SCCmecⅠ～Ⅲ型被归为医源性MRSA（healthcare-associated MRSA，HA-MRSA），携带多耐药基因；而Ⅳ～Ⅵ型被归为社区源性 MRSA（community-acquired MRSA，CA-MRSA），Ⅴ型携带多耐药基因，余2型只携带mecA。最近，Berglund等[3]从CA-MRSA中发现了1个新的类型（5C1，暂被定为Ⅶ型）。而Zhang等[4]从1个典型HA-MRSA流行株C10682中发现了1个从未被描述过的类型（4A，暂定为Ⅷ型）。

与MRSA相比，MRSE具有更高的基因多样性。日本一项社区带菌者的研究显示约40.8%的MRSE菌株含有SCCmecⅣa型组分，与世界范围流行的CA-MRSA相似；很大一部分菌株含有非典型SCCmec结构（与经典类型相比），它们的基因型是多样的，没有发现一种具有单一稳定基因型的CA-MRSE克隆株的传播；同时，在社区源性耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌（CA-MRCNS）和CA-MRSA中存在相同的SCCmec类型也揭示了SCCmec成分在种间与种内传播的高度可能性[5]。

芬兰一家医疗单位分离出的61例MRCNS中，49例（80%）为MRSE。SCCmec类型分布是多样的：20例（33%）Ⅳ型,11例（18%）Ⅴ型,4例（6%）是Ⅰ型,3例（4%）Ⅱ型,还有23例（38%）是新类型；有2例同时携带MRSA和MRSE，并且这些菌株中都含有SCCmecⅤ型，由此可以推测在MRSA和MRSE之间可能有SCCmecⅤ型成分的水平迁移[6]。当前对SCCmec的具体来源还不清楚，在MSSA中并没有mecA的等位基因，由此目前流行一种假说：SCCmec可以在葡萄球菌之间传播，并且mecA阳性（+）的CoNS（主要是MRSE）也许为SA构成了一个这些遗传元件及耐药基因的储蓄库[7]。

国内医疗单位分离的菌株显示，经典的医源性SCCmec类型仍占主导地位，未发现含SCCmecⅣ、Ⅴ型的菌株[8]。上海一家教学医院分离出的SE临床菌株中，多位点序列测定分析显示80株菌株中共有16种不同的序列类型，其中ST2类型代表了被测菌株的绝大部分，共检出4种SCCmec类型，无一例携带SCCmecⅠ型，所有ST2菌株均携带SCCmecⅢ型[9]。这些报道与国外的MRSE主要含有SCCmecⅣ和Ⅴ型且有基因多样性不同，提示在中国的医疗单位中MRSE主要携带医源性SCCmec类型。

2 SE生物膜特点

生物膜对细菌的保护作用在于：构成抗生素的渗透屏障；减低宿主的免疫应答、抑制吞噬细胞的防御功能，从而导致感染呈现慢性、持续性和反复性的特点，很难治愈。生物膜形成主要分以下阶段：首先，细菌初始黏附在植入物体或宿主组织表面；随后是细菌聚集，包括细菌增殖、细菌之间相互黏附及胞外多糖黏质的形成等；第3步是生物膜成熟及分离阶段。各阶段需要不同的相关因子参与。

2.1 SE初始黏附 细菌的初始黏附是形成SE感染的第1步，具有重要作用，由于大多数生物膜在6 h内开始形成，因此在植入术后6 h内减少细菌附着对避免医疗装置相关感染尤其重要[10]。生物材料植入人体后,很快被体内多种基质或血浆蛋白（纤维蛋白原、纤连蛋白、玻连蛋白，胶原蛋白等）覆盖，形成一层蛋白吸附层，使进入机体的细菌附着在材料表面。细菌初始黏附通过2种作用实现：可逆的、非特异性物理化学力和不可逆的、特异性的配体/受体间相互作用。通常前者无特异性，随机体吞噬作用、血流的冲击和抗生素的应用而被迫迁移或被杀灭。但若细菌受体遇到能与之结合的生物材料或材料表面吸附蛋白层中的配体时，则牢固地黏附在其表面，完成黏附过程中受体与配体的结合。

SE有多种黏附因子，其中识别黏附基质分子的微生物表面组分（microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules,MSCRAMMs）在黏附定植过程中起重要作用。SE和SA都能表达许多MSCRAMMs蛋白，能结合人基质蛋白如纤维蛋白原、纤连蛋白等。SE的MSCRAMMs主要包括Fbe、AtlE及Ssp等。MSCRAMMs可以通过共价或非共价结合连接到细菌表面。共价附着由转肽酶催化，它能使MSCRAMMs的一个保守模序——LPXTG连接到肽聚糖上。SA能编码28种表面蛋白，在SE中已有18种被识别。在SA的表面蛋白中，21种含有LPXTG模序，相比之下，SE只有11种左右，它们在生物膜形成中的作用尚不清楚[11]。SE和SA都有几种非共价结合到细菌表面的表面蛋白，最常见的是AtlE，非共价结合到磷壁酸上。除了能使细胞壁更新，它也能促进细菌附着到生物材料表面且能与玻连蛋白结合，具有双重作用[12]。

部分SE的表面蛋白因为具有特征性的丝氨酸-天冬氨酸重复跨细胞壁区域（Sdr）被归为Sdr家族蛋白。例如与纤维蛋白原结合的SE表面蛋白被称作纤维蛋白原结合蛋白（Fbe，也称作SdrG），由fbe基因编码。与已知的蛋白进行序列比较，发现Fbe与SA的凝集因子A（clfA）有相关性[13]。国内研究报告，与fbe基因缺陷的突变体相比，fbe阳性的S.epidermidis HB菌株更可能引起中心静脉导管相关感染，导致菌血症和转移病灶[14]，这些结果证实了在SE引起的中心静脉导管相关感染中与Fbe相关的黏附的重要作用。SdrF通过其B区域附着到存在于传动系统表面的宿主胶原蛋白上[15]，它可能在SE引起的心室辅助装置系统感染的起始过程中起重要作用。

2.2 细菌增殖和聚集 在生物材料表面初始黏附后，细菌增殖、相互黏附形成多层的细菌簇，分泌胞外多糖黏质，形成生物膜。在此阶段，需要多糖胞间黏附素（PIA）、聚集相关蛋白（Aap）、生物膜相关蛋白（Bap)及血凝素等因子参与。其中PIA在葡萄球菌生物膜形成机制中所起的调节作用研究最多，它不仅能促进初始黏附，在聚集阶段更具有重要作用，与其他多聚物如磷壁酸和蛋白等一起形成黏质的主要部分。研究显示，在SE中PIA的产生和去乙酰基作用被认为是重要的毒力因子，并对细菌的免疫逃避过程起作用[16]。

然而，一些从生物膜相关感染者分离的菌株缺乏ica基因（PIA的调控基因）,表明PIA的产生并不是对生物膜形成和生物膜相关感染都有普遍重要性。在非PIA依赖性的生物膜形成过程中，表面黏附蛋白如Aap、Bap等代替了PIA发挥促进细菌间黏附的作用[17]。

2.3 生物膜成熟及分离阶段 经历了以上阶段，成熟的生物膜形成复杂而有组织的结构，它由微菌落组成，在微菌落之间围绕着输水通道，可以为生物膜中的细菌运送养料、酶、代谢产物和排出废物等。根据菌种、营养、附着的表面和环境条件不同，细菌增殖时可以形成疏松或致密及厚薄不等的生物膜结构。

成熟的生物膜在外部冲击力或内在调节机制等作用下可部分脱落，转变成浮游状态，遇到合适的表面可以再次黏附形成新的生物膜，此过程对细菌持续感染及播散到其他定植部位具有重要作用。分离的主要相关因素有[18]：（1）机械力，例如血流的冲刷力。（2）形成生物膜的原料产生停止，如胞外多糖。（3）包括能破坏基质的酶类或表面活性剂在内的分离因素。当破坏基质的酶类或表面活性剂以较高的速率产生时将引起生物膜的分离，尤其在生物膜表面区域。实际上，可控的分离使生物膜维持一定的厚度，并控制生物膜以特定的速率播散。在葡萄球菌中，这种机制是由菌落密度传感系统调控的。

3 生物膜形成的基因调控

生物膜的形成是一个极为复杂的过程，受许多因子调控，目前对其具体调控机制还不完全清楚。菌落密度传感系统是细菌生物膜形成的一种重要调控机制，在葡萄球菌中最重要的是辅助基因调节（accessory gene regulator，agr）系统，最初在SA中被发现，它看起来不影响ica表达和PIA产生。在SA中经典的密度感受系统包含当细菌密度低时对黏附因子如MSCRAMMs的上调，这种情况发生在感染的开始；当完成定植后，agr系统作用增强，废止一些不需要的定植因子的表达。大量研究显示，SA中许多MSCRAMMs的表达受agr的负性调节[19]。目前对SE生物膜基因调节方面的研究相对较少。Yarwood等[20]认为在不同生长条件下，agr对生物膜形成的调节可以从正向到负向不同，这也许反映了agr系统对外部环境的反应性。另一种密度传感系统，luxS系统最近被认为是SE生物膜形成的另一种负调节基因[21]。

PIA的生物合成是由ica基因位点调控的，它包括N-乙酰胺基葡萄糖转移酶（icaA和icaD）、PIA脱乙酰酶（icaC）和一个调节基因（icaR）[18]。ica基因位点的表达受多种环境因子及调节蛋白的调控。在SA和SE中，一些全局调节因子能调控ica转录或PIA表达：包括DNA结合蛋白SarA和sigma因子SigB的上调作用，反之，luxS系统发挥下调作用[21-22]。具体的调节机制很复杂。研究认为SigB调节SE生物膜形成，对SA则似乎无此作用[23]。SigB通过抑制icaR转录进而增强icaADBC的转录。SarA能结合ica操纵子的启动子通过icaR-非依赖机制正向调节ica操纵子表达[22]。SE的sarA与SA同源率84%，SA的3种sarA启动子P1、P2、P3均存在于SE中，但这些启动子之间的组合和间距与SA不同，提示sarA在2种细菌之间发挥的作用可能不同[24]。

目前，SE已从传统意义上的条件致病菌转变为一种重要的病原菌，必须引起更多关注。在生物材料相关感染中，SE是最主要的致病菌。这种感染一旦发生，仅应用抗生素往往是不够的，多数情况下需要将植入物从体内移除，从而导致治疗失败。另外，一些慢性疾病，如2型糖尿病，将带来更大的免疫力低下的高危人群，这将增加SE感染，尤其是MRSE感染的发生。目前对SE的具体致病机制尚不完全清楚，需进行更多研究来发现新的药物及疫苗靶点，为临床治疗带来帮助和指导。

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