不同血液净化方式的尿毒症患者血清中毒素对单核细胞分泌炎症因子的影响

刘 玲,钟 玲,冯利平,张 玲

动脉粥样硬化 (AS)的实质是炎症,单核细胞是 AS形成过程中最重要的炎症细胞,同时也是动脉粥样硬化斑块的重要组成成分[1]。它活化后可通过分泌炎症因子 [如 IL-6和单核细胞趋化蛋白 -1(MCP-1)],产生一种促炎环境,促进 AS的发生发展。本研究通过体外试验,将不同血液净化方式治疗前后尿毒症患者血清与单核细胞共同培养,观察血清中毒素对单核细胞分泌炎症因子 IL-6和 MCP-1的影响,并探讨不同血液净化方式对其的干预作用。

1 资料与方法

1.1 病例选择 尿毒症患者 60例,均为我院 2008年 5月住院或门诊行血液净化治疗的维持性血液透析患者,男 30例,女 30例,年龄 25～88岁,平均 (61±15)岁,透析龄 3～96个月,平均 (23±17)月。根据不同血液净化方式,将患者随机分为 3组:(1)单纯血液透析 (HD)组20例,其中男 9例,女 11例,平均年龄 (60±17)岁,采用常规血液透析治疗 4 h,滤过膜采用血仿膜,膜表面积 1.4 m2,血流量 230～280 ml/min,透析液流量 500 ml/min,透析机为德国贝朗 DIALOG单泵机;(2)血液透析联合血液滤过 (HDF)组 20例,其中男 10例,女10例,平均年龄 (61±16)岁,采用血液透析滤过治疗 4 h,采用高通量聚砜膜,膜表面积 1.2 m2,超滤系数 42,血流量 230～280 ml/min,前稀释法,置换液流量3 600 ml/h,置换液由机器配制,透析机为德国贝朗 DIALOG+On line双泵机;(3)连续性肾脏替代治疗 (CRRT)20例,其中男 11例,女 9例,平均年龄 (61±15)岁,采用连续性肾脏替代治疗 8 h,采用日间连续性静脉 -静脉血液滤过(CVVH)法,下机前 2 h换为日间连续性静脉 -静脉血液滤过透析 (CVVHD)模式,选用高通量聚砜膜,膜表面积

1.2 m2,超滤系数 42,血流量 230～280 ml/min,前稀释法,置换液流量 4 000 ml/h,置换液根据谢志萍等[2]配方手工配制,透析机为德国贝朗 CRRT机。所有患者统一使用一次性透析器,普通肝素或低分子肝素抗凝。入选标准:透析龄≥3个月,病情稳定,近 1个月无严重急、慢性感染、心力衰竭、活动性肝炎、不稳定性心绞痛及手术史。3组不同血液净化方式患者年龄、性别分布间有均衡性。同时选取 15例年龄、性别匹配的健康人员作为对照组。

1.2 血清制备 各组尿毒症患者分别于血液净化治疗前和治疗结束后 10 min留取外周静脉血 5 ml,健康对照者于清晨空腹留取静脉血 5 ml,标本采集后立即置 37℃温箱孵育 2 h,然后低温 (4℃)离心分离血清,EP管分装后储存于 -70℃冰箱。所有血清标本使用前均用 0.22μm的微孔滤器除菌,并检测内毒素水平。

1.3 人单核细胞 (PBMC)来源、培养方法及实验分组

1.3.1 PBMC来源和培养方法 无菌抽取 10例尿毒症患者空腹静脉血各 10 ml加到肝素抗凝管中,用淋巴细胞分离液分离PBMC,Hanks液洗涤 3次后,将所有分离的 PBMC混合,台盼蓝染色计数活细胞数 ＞95%,再用含 10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素的 RPMI-1640培养液将 PBMC配成 1×106/ml的细胞悬液,按每孔 1 ml转种于 24孔培养板,培养于 37℃、二氧化碳浓度为 5.0%的孵箱中。

1.3.2 实验分组 分组进行实验:(1)健康对照组,含 5%健康人血清;(2)尿毒症患者组,分 HD组、HDF组、CRRT组,含 5%患者血清。

1.4 方法 在含 PBMC的细胞悬液的 24孔培养板中分别加入不同血清 50μl(每个样本做 2个复孔),于 37℃5.0%二氧化碳浓度下培养 24 h,吸取上清液,-20℃冻存待检。酶联免疫吸附法 (ELISA)检测 IL-6、MCP-1、同型半胱氨酸(Hcy)、晚期糖基化终产物 (AGEs)和甲状旁腺激素 (iPTH)的水平。IL-6、MCP-1、Hcy试剂盒由美国 ADL公司提供,AGEs、iPTH试剂盒由美国 USCN LIFE公司提供,内毒素试剂盒由科德角国际生物医学科技 (北京)有限公司提供,按说明书操作。晚期氧化蛋白产物 (AOPP)的测定,按文献 [3]方法进行。

1.5 统计学方法 采用 SPSS 11.0统计软件进行数据分析。计量资料用以 (x±s)表示,组间比较采用 One-way ANOVA检验。

2 结果

2.1 4组受检者血液净化前后血清的内毒素水平 4组受检者血液净化前血清内毒素水平比较差异有统计学意义(P＜0.01);HD组患者血液净化后血清内毒素水平升高,与血液净化前比较差异有统计学意义(P＜0.01);HDF组和 CRRT组患者血液净化前后血清内毒素水平比较差异无统计学意义(P＞0.05,见表 1)。

表 1 4组血液净化前后血清内毒素水平比较 (x ±s,EU/ml)Table 1 The levels of serum endotoxin in MHD patients and normal control before and after different modes of blood purification

2.2 健康对照组和尿毒症患者组血液净化前血清 Hcy、AOPP、AGEs和 iPTH水平 血液净化前尿毒症患者组血清Hcy、AOPP、AGEs和 iPTH的水平明显高于健康对照组,差异有统计学意义 (P＜0.01,见表 2)。

2.3 不同血液净化方式治疗对尿毒症患者血清尿毒症毒素的清除情况

2.3.1 不同血液净化治疗对 Hcy的清除情况 3种血液净化方式血液净化后 Hcy水平均有下降,其中 HDF、CRRT血液净化前后比较差异有统计学意义 (P＜0.01),而 HD治疗前后差异无统计学意义 (P＞0.05,见图 1)。

2.3.2 不同血液净化治疗对 AOPP的清除情况 3种血液净化方式治疗后 AOPP水平均有下降,HDF、CRRT治疗前后比较差异有统计学意义 (P＜0.01),而 HD治疗前后差异无统计学意义 (P＞0.05,见图2)。

2.3.3 不同血液净化治疗对 AGEs的清除情况 3种血液净化方式治疗后 AGEs水平均有下降,HDF、CRRT血液净化前后比较差异有统计学意义 (P＜0.01),而 HD治疗前后差异无统计学意义 (P＞0.05,见图3)。

2.3.4 不同血液净化治疗对 iPTH的清除情况 HDF和 CRRT治疗后 iPTH水平下降,治疗前后比较差异有统计学意义 (P＜0.01),而 HD治疗后 iPTH水平略上升,治疗前后比较差异无统计学意义 (P＞0.05,见图 4)。

表2 MHD组与健康对照组血液净化前血清 4种毒素水平比较 (x ±s)Table 2 The levels of serum UToxs before blood purification in MHD patients and normal control

图 1 不同血液净化治疗前后 Hcy的水平Figur e 1 The level of Hcy before and after differentmodesof blood purification

图 2 不同血液净化治疗前后 AOPP的水平Figur e 2 The level of AOPP before and after different modes of blood purification

图 3 不同血液净化治疗前后AGEs的水平Figur e 3 The level of AGEs before and after different modes of blood purification

图 4 不同血液净化治疗前后 iPTH的水平Figur e 4 The level of iPTH before and after different modes of blood purification

表 3 4组受检者血液净化前后单核细胞分泌 IL-6和 MCP-1水平比较(x ±s, μg/L)Table 3 The level of IL-6 and MCP-1 secreting by PHT-1 cell

2.4 4组受检者上清液中炎症因子水平比较 与尿毒症组血清共同培养的 PBMC分泌的 IL-6水平显著高于健康对照组(P＜0.01);HD组血液净化前后 PBMC分泌的 IL-6水平差异无统计学意义 (P＞0.05);HDF组及 CRRT组血液净化后PBMC分泌的 IL-6水平明显低于血液净化前 (P＜0.05)。与尿毒症组血清共同培养的 PBMC分泌的 MCP-1水平显著高于健康对照组 (P＜0.01);HD组血液净化前后 PBMC分泌的 MCP-1水平差异无统计学意义 (P＞0.05);HDF组及CRRT组血液净化后 PBMC分泌的 MCP-1水平明显低于血液净化前,差异有统计学意义 (P＜0.05,见表 3)。

3 讨论

心血管疾病 (CVD)是尿毒症患者常见的并发症和首位死亡原因,AS是其最基本的病理学特征[4]。近年来,越来越多的研究认为 AS的本质是炎症,大量资料显示 AS斑块中不仅含有脂质,而且有大量炎症细胞浸润,其中单核细胞约占80%[1]。AS形成的早期,在多种因素作用下,单核细胞接触并黏附到损伤部位的血管内皮,继而进入动脉壁内膜下间隙,激活并分化成巨噬细胞,巨噬细胞产生许多物质如脂肪酶、活性氧或自由基,进一步使低密度脂蛋白 (LDL)分子氧化,通过其表达的清道夫受体不断摄取氧化的低密度脂蛋白 (ox-LDL),最终形成泡沫细胞,构成 AS脂质条纹的基础,同时单核细胞活化后可分泌大量炎症因子,主要成分为 IL-6和 MCP-1等,促进 AS的快速进展。Tzoulaki等[5]报道,IL-6是 AS进程中的炎症标志物,同时也是 CVD的独立危险因素。MCP-1可特异性趋化、吸引单核/巨噬细胞,导致炎症反应,在AS的发病机制中起重要作用[6]。

本研究结果显示,与尿毒症患者组血清共同培养的 PBMC上清液中炎症因子 (IL-6,MCP-1)的水平显著高于健康对照组。我们在预试验中已对患者血清中 IL-6和 MCP-1水平进行检测,发现血清中上述因子浓度远低于上清液,并且将血清加入到细胞培养液中后浓度再被稀释为 1/20,因此血清本身炎症因子水平差异对上清液中的 IL-6、MCP-1水平的影响极其微弱。健康人与血液净化患者血清的主要区别在于尿毒症毒素 (UToxs)的含量,提示 PBMC细胞分泌炎症因子的差异受 UToxs的影响。本研究临床部分已证实,维持性血液透析患者血清中 Hcy、AOPP、AGEs及 iPTH等水平明显升高,由于多种尿毒症毒素在患者循环中潴留,可进一步促进炎症和氧化应激反应,可能是导致慢性炎症的重要原因[3,7-9]。

HD组血液净化后上清液中 IL-6及 MCP-1水平较透前组稍升高,但没有显著差异。这可能与血液净化过程本身存在诱发炎症和氧化应激的潜在因素有关,如:透析膜生物不相容性可激活补体和单核系统及凝血和纤溶过程,产生大量前炎症因子和自由基;透析液中微生物和内毒素污染;血透中丢失亲水性小分子物质、微量元素和酶调节复合物,损伤抗氧化系统;充分透析后仍不能清除的中大分子毒素等。常规 HD采用的血仿膜透析器孔径较小,生物相容性相对较差,超滤系数低,仅能清除小分子毒素 (分子量 ＜500 Da)和少量中分子毒素 (分子量 500～5 000 Da)。AOPP是一组分子量较大的蛋白氧化产物 (60～600 KDa),而 AGEs(分子量 2 000～6 000 Da)和 iPTH(分子量 9 000 Da)属于中分子毒素,Hcy虽然分子量小,但体内游离形式的 Hcy很少,70%～80%以上与白蛋白结合。因此可能由于 HD不能有效清除中大分子 UToxs,体内蓄积的 UToxs诱导单核细胞分泌 IL-6和 MCP-1等炎症因子,进一步加重炎症状态,是 AS加速形成的病理机制之一。

本研究发现,HDF组和 CRRT组血液净化后上清液中 IL-6及 MCP-1水平明显下降。HDF是在 HD治疗基础上,增加对流过程,并选用生物相容性好、超滤系数高、孔径较大的高分子纤维膜,能有效去除中分子和部分大分子毒素。CRRT以对流方式缓慢、大量清除溶质,尤其在清除大分子毒素和炎症介质占有优势。因此 HDF组和 CRRT组血液净化后血清中的 UToxs浓度明显降低,提示低水平 UToxs对单核细胞的活化作用减弱,从而减少炎性因子的分泌。炎症反应是维持性血液透析患者发生 CVD并发症的重要病理基础,近年来越来越多研究显示,晚期尿毒症患者体内 UToxs潴留可能是导致炎症和氧化应激状态的重要原因[10-11],所以如何有效清除 UToxs对于防治心血管疾病有重要的临床意义。

综上所述,我们通过体外试验进一步证实 HDF或 CRRT治疗能减轻炎症反应,为 HDF和 CRRT延缓维持性血液透析患者心血管并发症提供了可靠的实验室依据。

1 Ross R.Atherosclerosis-an inflammatory disease[J].N Engl J Med,1999,340(2):115-126.

2 谢志萍,王晋文,沈德昆.CVVH治疗的两种置换液配方在连续性血液净化中的效果比较 [J].中国医学研究与临床,2006,4(4):8-9.

3 Witko Sarsat V,Friedlander M,Nguyen Khoa T,et al.Advanced oxidation protein products as novel mediators of inflammation and monocyte activation in chronic renal failure[J].J Immunol,l998,161(5):2524-2532.

4 Amann K,Tyralla K,Gross ML,et al.Special characteristics of atherosclerosis in chronic renal failure[J].Clin Nephrol,2003,60(1):S13-21.

5 Tzoulaki I,Murray GD,Lee AJ,et al.C-reactive protein,interleukin-6,and soluble adhesion molecules as predictors of progressive peripheral atherosclerosis in the general population:Edinburgh Artery Study[J].Circulation,2005,112(7):976-983.

6 DeGraba TJ,Siren AL,Penix L,et al.Increased endothelial expression of intercellular adhesion molecule-1 in symptomatic versus asymptomatic human carotid atherosclerotic plaque[J].Stroke,1998,29(7):1405-1410.

7 刘阳,刘尚喜,候凡凡.晚期糖基化终产物诱导单核细胞产生细胞因子的细胞内信号传导机制 [J].解放军医学杂志,2004,29(11):947-950.

8 Witko-Sarsat V,Gausson V,Nguyen AT,et al.AOPP-induced activation of human neutrophil and monocyte oxidative metabolism:a potential target for N-acetylcysteine treatment in dialysis patients[J].Kidney Int,2003,64(1):82-91.

9 王莹,王广,张福春,等.同型半胱氨酸诱导人单核细胞分泌趋化因子的氧化应激机制的实验研究 [J].中华心血管病杂志,2007,35(10):956-959.

10 左川,邱红渝,李孜,等.维持性血液透析患者炎症、氧化应激状态与心血管并发症的关系 [J].四川大学学报,2008,39(1):119-121.

11 Krasniak A,Drozdz M,Pasowicz M,et al.Influence of microinflammation and oxidative stress on atherosclerosis progression and calcifications in cardiovascular system of hemodialyzed patients during two years follow-up[J].Przegl Lek,2007,64(3):140-147.