五倍子、乌梅等45种中草药提取物对锯缘青蟹致病弧菌的抑菌作用研究

邱庆连 ，潘清清，2，张友平，3，刘 问，钱 冬*

（1.浙江省淡水水产研究所，浙江湖州 313000；2.浙江省三门县海洋与渔业局，浙江三门 317100；3.浙江省绍兴县农业局，浙江绍兴 312000）

弧菌是海水养殖的主要病原菌，可引起海水养殖鱼类、虾蟹和贝类的多种疾病[1,2]，给海水养殖造成了极大的经济损失。目前对于弧菌病的控制，还是采用以抗生素为主的化学药物治疗方法，抗生素的使用造成了严重的菌株耐药问题，环境耐药菌株的产生对人类健康造成了潜在的危害[3,4]。中草药具有无抗药性和药物残留、副作用小等优点，加上中草药资源丰富，近年来在水生动物病害控制方面日益受到人们的关注[5,6]。某些中草药还有促进机体生理代谢，提高机体抗病能力等作用[7]。

锯缘青蟹俗称青蟹，是浙江省重要的海水养殖蟹类。浙江省青蟹养殖年产量达到近3万t，占全国总产量1/3。近年来，沿海养殖锯缘青蟹长期受到病害的威胁。2006年青蟹全国平均发病率为13.77%，死亡率5.43%，全国青蟹因病害造成经济损失达2亿余元[8]。研究表明，弧菌是锯缘青蟹较为常见的分离菌株[9,10]，也是青蟹重要的继发病原，是引起青蟹养殖死亡的重要原因之一。作者从三门发病青蟹中也分离到较多的菌株，部分菌株对青蟹有较强的致病力。为从中草药来源中寻找可能的抗菌活性组份，减少抗生素等化学药物的使用，作者研究了45种常用中草药提取物对锯缘青蟹致病弧菌的抑菌作用。

1 材料与方法

1.1 试验菌株

拟态弧菌Vibrio mimicus SM060818、梅氏弧菌V.metschnikovii SM060813、霍利斯弧菌V.hollisae SM060913为本实验室分离自浙江三门发病锯缘青蟹。

1.2 试验仪器、药物和试剂

试验用离心机为Sigma 3K-15；药物称量精密电子天平为赛多利斯产品；细菌培养箱为上海精宏产品，细菌培养摇床为江苏太仓，高压灭菌锅为上海博迅公司产品。

试验用五倍子、川芎等45种中药购自湖州市慕韩斋药堂，用中药粉碎机充分粉碎后阴凉干燥处保存备。

抑菌试验用空白药敏滤纸片及营养肉汤和营养琼脂购自杭州天和生物技术有限公司，培养基使用时添加1%NaCl，均高压灭菌备用。

1.3 中草药的制备

1.3.1 药物水提取法[11]

取粉碎中药5 g，加水至75 mL，4℃浸泡12 h后，煮沸后用文火煎煮30 min，滤出煎液，再加相同体积的水煎煮。合并3次煎煮液，加热浓缩至7 mL，12 000 r/min离心10 min，取上清4℃保存备用。

1.3.2 药物醇提取法

取粉碎中药1 g，加5 mL 95%乙醇，浸泡，60℃水浴1 h，取上清4℃保存备用。

1.4 中草药提取物的药敏纸片制备[12]

分别取水提取法和醇提取法制备的药液上清，取20 μL滴加于直径6 mm的空白纸片上，50℃充分烘干备用。

1.5 中草药提取物的抑菌测定

采用纸片扩散法（K-B法）进行[13]，实验菌株经添加1%NaCl的营养肉汤培养振荡培养28℃18 h后，取菌液100 μL加至1%NaCl的营养琼脂平板上，用三角玻棒均匀涂布；将制备好的中草药提取物药敏纸片贴于涂布好菌液平板，28℃恒温培养24～48 h；测量并记录抑菌圈直径。

1.6 中草药提取物的最小抑菌浓度（MIC）测定

试验在添加1%NaCl的营养肉汤中进行，方法参照文献[11]试管2倍稀释法，本文采用96孔微量2倍稀释法测定进行:各个待测药物设10个稀释度,每个浓度设3个重复；每个培养孔中加入125 μL含不同浓度药物的培养液，随后加入稀释菌液25 μL浓度为6×106CFU/mL试验菌液，使最终菌浓度达到1×106CFU/mL；28℃恒温培养24 h，观察结果，以完全抑制待测菌生长的最低药物浓度作为最低抑菌浓度（MIC）。

待测中草药提取物的药物浓度采用干燥称重法确定，准确量取1.00 mL中草药提取物，加至1.5 mL离心管中，80℃烘箱烘干，称干重。

2 结果

2.1 中草药提取物对拟态弧菌抑菌活性

采用琼脂平板纸片扩散法（K-B法）对45种中草药提取物对青蟹分离菌进行的抑菌活性进行了体外检测，结果发现五倍子、乌梅、艾叶、天冬、秦皮、虎杖、知母等28种中草药提取物都有一定的抑菌效果；千里光、穿心莲等17种中药提取物对分离菌株无抑制作用。分析水提取法和醇提取法成份的抑菌活性，发现大部分中草药在2种提取液中都可存在抑菌活性成份，以水提取法的活性高于醇提取法；青蒿的水提取物对拟态弧菌SM060818无明显的抑菌活性，而醇提取物存在较强的抑菌活性（表1）。

表1 45种中草药提取物对拟态弧菌的抑菌作用Tab.1 Antibacterial effect of 45 Chinese herbs extractions to Vibrio minicus

2.2 中草药提取物对3种青蟹分离弧菌的抑菌活性

分析28种中草药提取物对3种青蟹分离弧菌的抑菌活性，结果表明：五倍子、乌梅、秦皮、艾叶等提取物抑菌作用较好，对3种分离菌株均有较好的抑菌效果；天冬、白头翁、赤芍、金银花、黄精、黄柏、青蒿等中草药仅对其中1～2个菌株有抑制作用(表2)。同时还发现，拟态弧菌分离株SM060818对各类中药提取物的抑菌灵敏度更好，霍利斯弧菌分离株SM060913相对不敏感，而梅氏弧菌的分离株SM060813则相对耐药。表2为抑菌活性较强的22种中药对3种弧菌分离株的抑菌试验结果。

表2 中草药提取物对3种青蟹分离弧菌的抑菌活性Tab.2 Antibacterial effect of Chinese herb extractions to Vibrio isolates from Scylla serrata

2.3 中草药提取物对青蟹致病弧菌的最小抑菌浓度（MIC）

从纸片扩散试验中选取有较好抑菌效果的9种中草药提取液，测定其对3种弧菌的最小抑菌浓度（MIC），结果见表3。由表3可见，这些提取物中以五倍子提取物的抑菌效果最好，对拟态弧菌、梅氏弧菌和霍利斯弧菌等的MIC分别为0.172 mg/mL、0.172 mg/mL和0.086 mg/mL，其次是乌梅提取物，对3种弧菌的 MIC 分别为 0.461 mg/mL、0.461 mg/mL 和 0.922 mg/mL，其他提取物的 MIC 范围在 1.04～167 mg不等（表3）。

表3 9种中草药提取物对青蟹分离弧菌的最低抑菌浓度（mg/mL）Tab.3 The MIC of 9 Chinese herbs extraction to Vibrio isolates from S.serrata

3 讨论

本文对45种中草药，采用水煎煮法和乙醇法进行了提取，用纸片扩散法分析了45种中药提取物对青蟹致病性弧菌进行了抑菌测定，结果表明：试验的45种中药提取物有28种中药提取物对1种以上的青蟹致病弧菌表现出抑菌作用，其中五倍子、乌梅、秦皮、艾叶等各种提取物对拟态弧菌SM060818、梅氏弧菌SM060813、霍利斯弧菌SM060913等3种菌株均有较好抑菌作用；天冬、白头翁、赤芍、金银花、黄精、黄柏、青蒿等中草药可对其中1～2种菌株有抑制作用。测定五倍子、乌梅、天冬等对致病弧菌的最低抑菌浓度(MIC)，其中五倍子和乌梅等药物对拟态弧菌和梅氏弧菌的MIC分别为0.172 mg/mL、0.461 mg/mL，这些结果为抗弧菌中药有效成份的研究提供了有益线索。

养殖青蟹近年来受到各类疾病的危害，白斑综合征病毒(WSSV)、血卵涡鞭虫以及弧菌等感染占青蟹病害的大多数[14,15]，其中弧菌的分离有较多的报道[9,10]。从作者近年来对青蟹分离菌株种类和分布来看，倾向于认为弧菌是青蟹重要的继发病原，在环境胁迫或其他病原感染时加剧青蟹的发病死亡。寻找有抗弧菌活性中草药，结合免疫增强剂的应用，对提高青蟹病害控制水平将起到积极作用，还可避免减少单一使用抗菌药引起的药物次级污染等危害，在青蟹养殖中有重要的应用价值。

近年来，抗生素诱导的细菌耐药性受到愈来愈多的关注[3,4]，抗生素的使用限制也日益严格，中草药来源抗菌药物的应用将日益受到广大研究者的关注。中药和其他天然抗菌活性物质是潜在新抗菌药物的前导化合物，抗菌活性成份的化学特性研究受到广泛的关注。就本研究测试的45种中药而言，水煎煮法所提取抑菌成份明显优于醇提取法，说明抑菌成份多为水性溶性成份，其特点为容易溶解和提取，但后期纯化和结构阐述较为困难，同时水煎煮法过程长、能耗大，还存在不耐热活性成份被破坏的风险，需要采用超声波、微波等新提取技术。此外，从中药提取物对弧菌的最低抑菌浓度（MIC）来看，效果最好的五倍子对弧菌MIC为0.172 mg/mL，抑菌效果大大低于目前常用抗菌药物，这是由于中药成份较为复杂，直接抗菌成份含量较少而致。许多中药不同程度地存在免疫增强和机理调理等成份，不能以简单抑菌作用强弱来评价一种中药提取物的药用价值。通过加强对五倍子、乌梅等有较好抗菌力中药活性成份提取和抑菌机理研究，对于寻找有潜力的抗菌化合物，有重要的应用价值。

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