生鲜乳中动物水解蛋白的测定

王昇 石来凤 阿力腾才斯克 赵晓凤 新疆维吾尔自治区兽药饲料监察所

L-羟脯氨酸是人体非必需氨基酸，是胶原蛋白（动物水解蛋白）特有的氨基酸，占正常胶原蛋白氨基酸总量的10%以上，是衡量机体胶原含量的一个重要指标，牛奶中不含此氨基酸。

动物水解蛋白是一种廉价的工业原料，最常见的就是皮革粉。将其掺入牛奶或奶粉中可提高蛋白质的含量。如果人食用掺入动物水解蛋白的产品，则会导致消化不良，吸收利用率降低，从而影响人体健康。

1 测定原理

试样经酸水解后，过滤，用稀盐酸溶解，注入氨基酸分析仪进行测定。采用外标法定量。

2 试剂与材料

2.1 除非另有规定，应选用优级纯试剂和符合GB/T 6682规定的一级水。

2.2 盐酸7.8mol/L，将650mL优级纯的浓盐酸小心倒入350mL超纯水中，混匀。

2.3 配制茚三酮显色液，方法如表1所示。

2.4 配制苯酚水溶液（5.0%，w/v）：称取苯酚5.0g，溶于100mL水中。

2.5 配制盐酸溶液（0.1 mol/L）：量取盐酸（7.8mol/L）16.6mL，倒入1000mL水中。

2.6 L-羟脯氨酸标准品，纯度≥99%。

2.7 配制L-羟脯氨酸标准储备液：称取100mg（精确到0.1mg）羟脯氨酸标准品，用盐酸溶液（0.1mol/L）溶解并定容至100mL容量瓶中。该溶液的浓度为1000mg/L，于4℃冰箱内贮存，有效期3个月。

2.8 准备苯酚溶液。

2.9 L-羟脯氨酸标准工作液：准确吸取L-羟脯氨酸标准储备液1.00mL于100mL的容量瓶内，用盐酸溶液（0.1mol/L）定容。该溶液的浓度为10.00mg/L，于4℃冰箱内贮存，有效期1周。

3 仪器与设备

L-8900氨基酸自动分析仪、电热恒温干燥箱、配有聚四氟乙烯密封盖的水解管、电子天平（精确到0.0001g）、定量滤纸、0.45μm水性样品过滤器（直径13mm）、氮吹仪。

4 分析步骤

4.1 样品处理

称取1～2g（精确至0.001g）牛奶样品于水解管中，加8.00mL盐酸，滴入3滴苯酚溶液，用一级水补足10.00mL，充氮后封管，置于110℃烘箱中保持22～24h，冷却后经滤纸过滤。取0.400mL滤液于氮吹仪上吹干，残留物用2.00mL盐酸溶液（0.1mol/L）溶解，过0.45μm滤器，备用。同时做空白对照。

表1 日立L-8900型氨基酸分析仪茚三酮溶液的配制方法

4.2 样品测定

4.2.1 氨基酸分析仪条件

①分离柱：6 0 m m×4.6 m m（i.d）不锈钢柱，交换树脂为氨基酸分析专用树脂；②柱温：反应柱57℃、分离柱135℃；③泵流速：泵10.400mL/min、泵20.350mL/min；④进样体积：20μL；⑤检测波长：440nm；⑥茚三酮显色液：可按表1配制，也可根据仪器自身要求配制；⑦流动相缓冲液：可按照表2配制，也可根据仪器自身要求配制。

4.2.2 定量测定

按照外标法进行定量计算。

5 结果计算和表述

试样中L-羟脯氨酸的含量X，以质量分数mg/kg表示，单点校正按下式计算：

式中：

V1— 加入稀盐酸溶液定容的体积，mL；

V2— 水解液的定容体积，mL；

V3—水解样液的取样量，mL；

AS—L—羟脯氨酸标准溶液对应的色谱峰面积响应值；

A — 试样溶液对应的色谱峰面积响应值；

CS— L—羟脯氨酸标准溶液的浓度，Hg/mL；

m — 试样质量，g。

平行测定结果用算术平均值表示，结果保留3位有效数字。

6 重复性

在同一实验室由同一操作人员使用同一仪器完成的2个平行测定的相对偏差不大于10%。

表2 日立L—8900型氨基酸分析仪流动相缓冲溶液的配制方法

表3 生鲜乳中动物水解蛋白添加回收率结果（上机测定液中）

表4 生鲜乳中加标重复性测定结果

7 L-羟脯氨酸的添加回收率测定

选择未添动物水解蛋白的生鲜乳样品，再分别添加不同量的动物水解蛋白，测定添加回收率，实验结果如表3所示。

8 方法的重复性测定

在不含L-羟脯氨酸的乳品中人为添加少量定量的标品，进行方法重复性验证实验，其相对标准偏差应小于10%，测定结果如表4所示。

9 小结

动物水解蛋白是以结缔组织中的胶原蛋白为原料，在严格控制的条件下进行水解、精制而成的氨基酸多肽。本方法的检出限为25mg/kg，如果用本方法能检出，相当于牛奶中掺皮革粉在0.025%以上。