中药枸骨根中槲皮素的提取分离与鉴定

曾海波,曾荣今,姚 飞

(湖南科技大学化学化工学院,湘潭411201)

枸骨(Llex cornutaLindl)为冬青科的常绿灌木或小乔木,分布浙江、江西、湖南、广西等地.近年来对枸骨叶成分的研究发现,其富含多种具有广泛生物活性的黄酮类化合物,如芦丁、杨梅甙、槲皮素、山奈酚、金丝桃甙、异鼠李素等[1-3]这类物质大多有抗菌、消炎和扩张血管等作用[4].目前对枸骨根成分的研究还很少,本文初步探索了从枸骨根中提取分离黄酮类物质,并首次从枸骨根中提取分离得到了黄酮类化合物--槲皮素.

1 材料与仪器

1.1 材料

(1)原料

枸骨根系课题组采自湖南隆回县,由湖南科技大学化学化工学院曾荣今教授鉴定.

(2)试剂

甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸乙酯、氯仿、石油醚、醋酸均为分析纯,由湖南师范大学试剂厂提供.硅胶:100～200目,200～300目柱层析用硅胶,青岛海洋化工厂.

1.2 仪器

HPLC:Waters Delta高效液相色谱仪(包括600泵、996 PAD检测器,Millennium32数据处理系统),色谱柱:Waters C18 Column;

LG-500粉碎机,转速2500 r/min;

SB320型超声波震荡仪(Shanghai Branson);

Sigma 3K15离心机,最大转速:15300 rpm,最小转速:100 rpm;

RE-52A型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司);

SHZ-D(Ⅲ)型循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司);

2 提取分离纯化工艺

将洗净的枸骨根在70℃恒温干燥、粉碎,称取4 kg枸骨根用粉碎机粉碎成100目粉末,按照液料比(V/W)12∶1,用70%乙醇浸泡枸骨粉末3 h后,再用超声震荡提取30 min,得到的提取液用旋转蒸发器减压浓缩,回收溶剂.再用回收的溶剂重新浸泡滤渣,多次重复提取,直到提取液颜色为很淡的黄色;合并浓缩物,再减压浓缩至有少量黑色浸膏的棕黄色液体,过滤.滤渣用热水浸提,过滤,洗液和滤液合并,经减压蒸馏后,再用乙酸乙酯萃取,得乙酸乙酯提取物.所得乙酸乙酯提取物经减压蒸馏、无水硫酸钠干燥得到提取物固体.将提取物固体粉碎,加适量乙醇溶解、精制,用硅胶柱(140～160目)进行柱层析分离;依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇洗脱,收集氯仿洗脱液;将收集到的氯仿洗脱液浓缩,再硅胶柱(140～160目)进行柱层析分离,依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇洗脱.收集氯仿洗脱液,浓缩至干,甲醇溶解备用(浅黄色溶液).具体工艺流程如下图所示:

3 鉴定与分析

3.1 定性分析

三氯化铝反应:往样品的甲醇溶液中(淡黄色)加入1%的三氯化铝溶液,呈鲜黄色.紫外光下观察为黄绿色荧光.因为在含有黄酮类化合物的溶液中加入某种金属离子(如 Al3+、Zn2+、Til3+等),这时母核中某些位置上的H(3、5位上)为羟基所取代,能够与金属离子形成络合物,而黄酮类化合物与金属离子形成的络合物一般为黄色或橙色[5].据此推测所得的物质为黄酮类化合物.

3.2 红外光谱解析

各个峰的归属如下:1611.1 cm-1、1561.26 cm-1、1522.12 cm-1、1461.90 cm-1、 1450.19 cm-1:苯环的骨架振动,证明苯环的存在;3407 cm-1、3200 cm-1:强、宽的缔合,证明有 O-H;1665.05 cm-1:羰基吸收峰[6].

3.3 质谱图解析

碎片峰有[M-H]-m/z301,[M+H]+m/z303,m/z285,m/z274,m/z153,m/z137;因为[MH]-m/z 301,[M+H]+m/z303所以分子离子M+m/z302.黄酮类化合物质谱图中分子离子峰应为偶数,通常是以主峰的形式出现;而且必须是一个合理的分子量[7].如黄酮、异黄酮类化合物以222为基数;黄烷酮和查尔酮类化合物为324;黄酮醇类化合物为238;双氢黄酮类化合物为240等.每加一个-OH就要增加16个质量单位,以此类推.而化合物的分子离子M+在m/z302.可以判断是黄酮醇类化合物增加了4个-OH.对质量数m/z303做二级质谱分别得到[M-18]+m/z285;[M-29]+m/z274(特征分裂);m/z153;m/z137.[8]质谱碎裂机制及各个峰的归属如下图所示:

3.4 核磁共振谱图

3.4.11H-NMR谱图解析

3.4.213C-NMR谱图解析

(13CNMR):δ175.68(C4),δ164.15(C2),δ161.39(C8a),δ156.85(C7),δ147.48(C5),δ146.08(C4′),δ144.97(C3′),δ135.88(C1′),δ122.85(C6′),δ120.57(C5′),δ115.31(C2′),δ114.48(C4a),δ103.22(C3),δ98.27(C8),δ93.57(C6).化合物的13C-NMR谱图给出的15个碳信号,是典型的C6-C3-C6的黄酮骨架结构;在δ175.68出现了黄酮醇C4的羰基(C=O)的典型峰信号[6].

4 结 论

根据以上结构数据的分析,本文获得的化合物光谱数据与文献[9-12]报道的槲皮素相关数据一致,基本可以确定该化合物为3,5,7,3＇,4＇-五羟基黄酮,又叫槲皮素(结构如下).

(分子式:C15 H 10O7)

虽然黄酮类化合物存在于许多高等植物中,但本文是首次从构骨根中提取到黄酮类化合物——槲皮素,对于深入研究构骨根的化学活性成份有重要意义.有关构骨根中其它成分的分离、结构鉴定有待我们进一步深入地开展工作.

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