OMⅢ株口蹄疫病毒P1-2A-3C腺病毒载体的构建

李 杨，柳纪省,2

（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃 兰州 730046）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（Food-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种感染偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病[1]，该病一旦爆发，将造成巨大的经济损失，是OIE规定的一类传染病。FMDV为单股正链RNA病毒，基因组全长约8.5 kb，由5′端非编码区、一个开放阅读框和3′端非编码区和Poly（A）组成[2]。P1编码区决定着病毒的抗原性和血清型[3]，其结构蛋白基因VP1位于全基因组的2 977～3 615核苷酸位点，编码213个氨基酸，为主要抗原位点，可产生中和抗体，诱导免疫反应，是重点研究对象[4]。编码FMDV的3种主要蛋白水解酶分别为L、2A和3C基因。其中，3C是一种极为重要的功能蛋白，其在多聚蛋白的裂解及病毒衣壳的组装过程中裂解病毒结构蛋白前体P1，最终得到成熟的病毒抗原[5]，还可使帽结构宿主细胞蛋白的合成关闭，为病毒蛋白的合成创造条件[6]。鉴于在蛋白酶3C的作用下前体结构蛋白P1最终裂解为 VP1、VP2、VP3、VP4[7]，组装成为完整的病毒粒子诱导机体产生保护性免疫应答[8]。笔者选用O型口蹄疫病毒的P1-2A和3C基因，以期获得能够高效表达具有免疫原性的FMDV抗原的重组腺病毒。

1 材料与方法

1.1 实验材料

OMⅢ型口蹄疫病毒、腺病毒表达系统（穿梭载体pAdTrack-CMV、骨架载体pAdeasy-1）；大肠杆菌BJ5183（中国农科院兰州兽医研究所提供）；HEK293细胞（由中国农业科学院兰州兽医研究所农业部畜禽病毒学重点开放实验）；克隆载体pMD18-T、JM109、DNA Marker、Pyrobest DNA polymeras、T4DNA连接酶、DNA快速纯化回收试剂盒、质粒快速提取试剂盒等（大连宝生物工程有限公司）；限制性内切酶 PacⅠ、PmeⅠ、salⅠ、BglⅡ、xbaⅠ（Biolabs公司）；RNA提取试剂盒（Qiagen公司）；脂质体lipofectAMINE2000（Invitrogen公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）。

1.2 引物的设计与合成

根据GenBank参考序列合成2对引物：P1-2A上 游 引 物 5′-ATAAGATCTACCATGGGAGCC-3′（引入 BglⅡ酶切位点）；P1-2A下游引物 5′-CGCGTCGACTGACATGTCCTC-3′(引入 salⅠ酶切位点)。PCR 扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃30 s，72℃ 3 min，共 30 个循环；72℃延伸 10 min。3C上游引物 5′-GCGGTCGACAAGAAACCTGTC-3′（引入salⅠ酶切位点）；3C下游引物5′-ATATCTAGACTACTCGTGGTG-3′（引入 xbaⅠ酶切位点）。PCR 扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min，共 30个循环；72℃延伸 10 min。以上引物由大连宝生物工程有限公司合成。

1.3 OMⅢ型口蹄疫重组腺病毒穿梭质粒的构建

按Qiagen公司的RNA提取试剂盒说明提取RNA，将总RNA用Oligo（dT）18引物在AMV反转录酶的作用下，42℃反转录制备cDNA。以获得的cDNA为模板，用2对特异性引物进行PCR扩增P12A和3C，将目的片段按常规方法连接到pMD18-T载体上。用相应的核酸内切酶进行酶切鉴定，凝胶电泳鉴定后送大连宝生物工程有限公司测序鉴定。将连接产物分别用BglⅡ/salⅠ和salⅠ/xbaⅠ酶切，分别与经同样两次酶切的腺病毒穿梭载体pAdTrack进行连接，使其处于强启动子CMV控制下。将连接产物转化大肠埃希氏菌JM109，抗性筛选阳性克隆后，提取质粒进行酶切和PCR鉴定，命名为pAdTrack-P12A3C。

1.4 OMⅢ型口蹄疫重组腺病毒质粒的构建

pAdTrack-P12A3C经PmeⅠ线性化后与腺病毒骨架载体pAdeasy-1共同电转化感受态细菌BJ5183，进行PacⅠ酶切鉴定和PCR鉴定，该重组腺病毒质粒命名为pAd-P12A3C。

1.5 重组腺病毒质粒转染HEK293细胞及遗传稳定性检测

用PacⅠ将pAd-P12A3C质粒线性化后，在Lipofectamine 2000的介导下转染HEK293细胞，转染后4～5 d细胞可观察到绿色荧光，传代后出现典型的细胞病变。反复冻融后离心，取上清液接种于单层HEK293细胞，并依次传至第10代。提取每代腺病毒基因组DNA，以此为模板扩增FMDV的P1-2A、3C基因，检测重组病毒的遗传稳定性。

2 结果与分析

2.1 目的基因P1-2A、3C的扩增及重组腺病毒穿梭质粒的构建

以筛选出的阳性质粒为模板分别扩增目的片段，扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测分别可见大小约2.3 kb和640 bp的片段条带，与目的基因大小相符。将穿梭载体pAdTrack和T-P12A同时经限制性内切酶BglⅡ和salⅠ酶切后进行粘末端连接，鉴定连接成功后获得重组质粒pAdTrack-P1-2A，再用限制性核酸内切酶salⅠ和XbaⅠ同时酶切pAdTrack-P12A和T-3C进行粘末端连接，经琼脂糖凝胶电泳可见约2.9 kp的条带，证明P12A和3C基因已成功克隆到了pAdTrack中（见图1、图 2、图 3）。

图1 O型FMDV 3C基因的扩增

图2 O型FMDV P1-2A基因的扩增

2.2 重组腺病毒质粒pAd-P12A3C的鉴定

pAd-P12A3C质粒经PacⅠ消化后，0.8%琼脂糖凝胶电泳检测可见大小约为4.5 kb的条带，和预期结果相符。序列测定及分析也证实了目的基因已正确重组到腺病毒骨架载体内（图4）。

2.3 重组病毒遗传稳定性和表达的检测

分别提取1～10代细胞总DNA为模板进行外源基因的PCR扩增，每代均扩增出目的基因，说明重组病毒能稳定遗传。转染的单层HEK293细胞48 h后采用间接免疫荧光试验，在荧光显微镜下可见特异的绿色荧光，而转染腺病毒骨架载体的HEK293细胞经同样处理后无荧光，证明目的基因在腺病毒载体中成功表达，HEK293细胞中含有FMDV 蛋白（图 5、图 6、图 7）。

图3 重组穿梭质粒酶切鉴定

图4 重组腺病毒质粒酶切鉴定

3 讨论与结论

图5 对照组正常HEK293细胞

图6 接毒试验组

图7 重组腺病毒感染HEK293细胞后的绿色荧光表达

目前，世界多数国家都采用疫苗免疫的方法来控制FMD疫情，FMD基因工程疫苗的研究已经历20 a，由于免疫效果不及传统的灭活苗，迄今仅有个别的产品上市，且市场占有率非常有限。究其原因，影响FMD基因工程疫苗免疫效力的因素较多，但其中最重要的原因之一是，不论原核表达还是真核表达，也不论是基因重组表达的亚单位疫苗还是用重组DNA进行免疫的核酸疫苗，多数研究工作都是围绕FMDV单个基因VP1在进行不同途径的探讨，而一些能增强免疫作用的基因却未被发现和利用[8]。2001年美国的Mary通过对FMDV全结构蛋白基因及非结构蛋白基因功能的研究，根据非结构蛋白（3C蛋白酶）可将全部结构蛋白基因P1的产物加工成结构完整的VP1、VP2、VP3和VP4多肽，从而形成完整的病毒衣壳。因而，就能最大限度地保留病毒颗粒上的多个抗原表位的情况，研究了FMDVP1+3C活载体疫苗。用该疫苗免疫的猪在同居感染试验中，获得了5/6的保护。这一试验结果表明，从全基因组水平筛选出的组合基因表达的融合蛋白的免疫效力已超过常规疫苗[9]。在口蹄疫活病毒载体疫苗研究中，目前FMDV结构蛋白基因已在大肠埃希氏菌、毕赤酵母、转基因植物和杆状病毒等表达系统中得到表达[10]，腺病毒载体是继逆转录病毒载体后在基因治疗、基因免疫等方面应用开发较早的一种病毒载体。其具有宿主范围广、对人致病性低、在增殖和非增殖细胞中感染、表达基因能同时表达多个基因、能在悬浮培养液中扩增等独特的优点[11]。基于以上优点，腺病毒被极其广泛地应用于体外基因转导、体内接种疫苗和基因治疗等各个领域[12]。

实验从FMDV全基因组水平筛选具有保护性免疫反应的免疫组合基因（免疫基因的主序列）作为目的基因，将目的基因插入腺病毒表达载体，通过脂质体、电穿孔法转化293细胞成功实现目的基因的表达。通过不同的分子检测方法检测，筛选出高效表达毒株。该试验为最终研制出安全、高效、实用的能表达FMD抗原的复制缺陷型腺病毒活载体疫苗提供了一些数据。

[1]吴国华，张 强.口蹄疫转基因植物可饲疫苗研究进展[J].动物医学进展，2008，29（4）：65-69.

[2]Strohmaier K,Franze R,Adman K H.Location and characterization of the antigenic portion of the FMDV immunizing protein[J].GenVirol，1982，59：295-360.

[3]吴锦艳，刘湘涛，胡永浩，等.猪口蹄疫病毒对三种动物细胞噬性的研究[J].甘肃农业大学学报，2005，403：306-310.

[4]MateuM G,ValeroM L,Andreu D,et al.Systematic replace-ment of amono acid residues within an Arg2Gly2Asp2 containing loop of foot-and-mouth disease virus and effect on cell recognitior[J].J BiolChem,1996,271：12814-12819.

[5]Mason P W,Grubman M J,Baxt B.Molecular basis of pathogene-sis of FMDV[J].VirusRes,2003,91（1）：9-32.

[6]Carrillo C,Tulman E,Delhon G,et al.Comparative genomics of foot-and-mouth disease[J].Virus,2005，79（10）：6487-6504.

[7]Mason P W,Grubman M J，Baxt B.Molecular basis of pathogenesis of FMDV[J].Virus Res,2003，91（1）：9-32.

[8]Zheng Z X,Xu Q X.Recombinant and synthetic vaccines:Biosynthetic peptide vaccine against foot-and-mouth disease virus[M].New Deli India:Naruse Publishing House,1994.30-35.

[9]Balamurugan V,Renji R,Saha S N,et al.Protective immune response of the capsid precursor polypeptide（P1）of foot-andmouth disease virus type‘O’produced in Pichia pastoris[J].Virus Research,2003,92（2）：141-149.

[10]King G D,Muhammad A K,Xiong W,et al.High capacity adenovirus vector-mediated anti-glioma genetherapy in the presence of systemic antiadenovirus immunity[J].J Virol,2008,82（9）：4680-4684.

[11]Oem J K,Park J H,Lee K N,et al.Characterization of recombinant foot-and-mouth disease virus pentamer-like structures expressed by baculovirus and their use as diagnostic antigens in a blocking ELISA[J].Vaccine,2007，25（20）：4112-4121.

[12]Rweyemamu M M,Terry G,Pay T W F.Stability and immunogenicity of empty particles of foot-and-mouth disease virus[J].Arch Virol,1979，59（2）：69-79.