黄鳍金枪鱼眼窝油中DHA含量测定方法的优化

周 敏，陶宁萍，王锡昌

（上海海洋大学食品学院，上海 201306）

金枪鱼（Thunnus obesus），英文名 Tuna。金枪鱼种类很多，经济价值较高的包括蓝鳍金枪鱼、马苏金枪鱼、大眼金枪鱼、黄鳍金枪鱼、长鳍金枪鱼和鲣鱼等6种。近年来，黄鳍金枪鱼（Thunnus albacores）捕获量不断增长，2006年为1.5 Mt[1]。金枪鱼罐头和生鱼片加工过程中产生的下脚料大约占总重量的50%～70%，这些下脚料废弃物主要是金枪鱼内脏，鳃，暗色肉，鱼头和鱼皮等[2]，金枪鱼头眼窝肉脂肪含量高，含有大量的多不饱和脂肪酸，尤其是DHA。DHA，二十二碳六稀酸，俗名脑黄金，人体内不能合成，只能从富含DHA食物摄取。它有较高的药理价值，对于心血管病、炎症、癌症、增强免疫力、健脑益智和保护视网膜等有疗效[3]，近年来引起国内外广泛重视。

超临界CO2萃取法具有操作简便、无溶剂残留、选择性强等优点。GC/MS配备高灵敏度的动态质谱仪和数据系统，无需标准品即可对未知物质定性。笔者采用超临界CO2法从黄鳍金枪鱼眼窝肉中提取鱼油，经研究发现此方法提取鱼油的品质较好。利用GC/MS外标法测定了眼窝油DHA含量，具有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为冷冻黄鳍金枪鱼头购于北京中洋环球金枪鱼有限公司，共二批鱼，鱼头重4～4.5 kg。

仪器：Speed SFE超临界CO2萃取仪，购于美国Applied Separations公司；Agilent 6890N-5975i气相色谱质谱仪（USA），色谱柱 DB225 ms（60 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W，USA）。

试剂：DHA甲酯标准品（纯度>99%），购于美国SIGMA公司；0.5 mol/L NaOH－CH3OH溶液；正己烷、甲醇均为色谱纯、氢氧化钠为分析纯。

1.2 样品前处理

黄鳍金枪鱼头解冻、清洗、去除皮和骨头，获得眼窝肉（眼睛周围的肉）和杂肉（除眼窝肉的肉）。将眼窝肉放入绞肉机中混匀破碎，然后置-20℃冰箱冷冻备用。眼窝肉的重量约占总鱼头重量的1.4%。眼窝肉脂肪含量约28.5%，杂肉脂肪含量约2.0%。

1.3 超临界CO2法提取鱼油工艺流程

称取绞碎的眼窝肉35 g装于萃取釜中，设定萃取温度、分离温度，检查设备的气密性。CO2经净化后进入冷凝箱即液化冷凝至流体，与N2一起经高压计量泵加压至设定压力，经加热器加热至预定温度后进入萃取釜进行萃取。金枪鱼油萃取物经分离阀放出并收集，再经离心后收集鱼油，精确称量鱼油的重量。提取率计算公式：

1.4 DHA测定

1.4.1 鱼油的快速甲酯化 称取1 g眼窝油溶于含有10 mL正己烷的带塞试管中，震荡10 min，使其完全溶解，再加入2 mL 0.5 mol/L NaOH—CH3OH溶液，振摇后置于50℃水溶液中约30 min，使其完全酯化，取上清液进样。

1.4.2 GC-MS检测条件 离子源70 eV，流动相He，分流比 30∶1，进样量 1 μL，进口温度 170℃，保持6 min，以5℃/min升温至230℃，保持30 min。

1.4.3 DHA定量 用正己烷将DHA甲酯标准品稀释至一系列浓度梯度 0.65、2.15、3.65、5.15、6.65 mg/mL。按照1.4.2条件进行测定，采用外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 超临界CO2法提取鱼油最佳工艺条件的确定

根据中心旋转试验设计，以单因素试验结果为中心，设计出响应面试验方案。试验结果见表1，通过响应面回归分析，超临界CO2法萃取金枪鱼油的优化工艺条件为萃取时间185.7 min，萃取温度57.8℃，萃取压力35.8 MPa，金枪鱼油萃取率为20.2%。表1中的试验值与预测值相似，表明回归方程和实验值具有高度的拟合性。对在此条件下提取的眼窝油进行DHA含量的测定。

2.2 DHA标准曲线的绘制

根据DHA标准品的不同浓度0.65、2.15、3.65、5.15、6.65 mg/mL的出峰面积，绘出峰面积对浓度的标准曲线，如图1。

2.3 眼窝油预处理方法的选择

表1 RSM试验方案及结果

图1 DHA的标准曲线

鱼油中脂肪酸的测定通常要先进行甲酯化，其作用是把高沸点不易挥发、汽化的脂肪酸酯先水解或皂化得到脂肪酸和甘油，再使脂肪酸与甲醇反应生成相应的脂肪酸甲酯（甲酯化）使其变成低沸点易挥发、汽化的物质，或由油脂直接与甲醇发生醇解反应制取脂肪酸甲酯，从而降低汽化温度，提高分离效果，有利于气相色谱法分离并逐一测定其组成和含量[4]。通常甲酯化的方法有酸法甲酯化、碱法甲酯化和三甲基硅重氮甲烷甲酯化等。由于酸法甲酯化程度不高；三甲基硅重氮甲烷甲酯化针对游离脂肪酸甲酯化程度较好。因此，本研究采用碱法甲酯化，即NaOH—CH3OH法，该法甲酯化程度高，具有操作简单、快捷的特点。

鱼油快速甲酯化后，用此方法连续测定5次，测定结果相对偏差1%，符合色谱定量分析的允许相对偏差范围，证明该方法具有很好的精密度。

2.4 GC/MS测定方法的选择

脂肪酸的极性强，根据相似相容原理，选择极性强的色谱柱DB 225 ms，它不仅适合于分离脂肪酸，而且热稳定性好高温不易流失、且漂移小。因此，DB 225 ms色谱柱为最佳选择。

由于眼窝油中成分较复杂，含有不同种类的脂肪酸，若采用恒温测定，分离效果差，因此，选择程序升温测定，经多次实验摸索，得到分离效果较好的程序升温170～230℃，每分钟上升5℃。

2.5 DHA定性分析

由图2可知，各个峰的分离效果很好。由于各脂肪酸为同系物，一般按从短碳链到长碳链的顺序出峰，通过NIST谱库检索和分析，检出DHA的出峰时间为42.1 min，还检测到其他脂肪酸成分如硬脂酸、油酸、花生四烯酸和EPA等多种脂肪酸的出峰时间分别为 20.5、21.0、28.6、30.6 min 等，因而眼窝油含有丰富的脂肪酸成分。由图3和图4比较可知，眼窝油中DHA棒图和NIST谱库中DHA棒图相似，证明此试验误差小，定性准确率高。

图2 眼窝油的脂肪酸总离子流图

图3 眼窝油中DHA棒图

2.6 DHA定量分析

眼窝油中DHA的峰面积是3.55×108在标准曲线的范围内，将峰面积代入标准曲线方程，得到浓度为1.96 mg/mL，最后计算得眼窝油DHA的含量为19.6 mg/g，相对总脂肪酸含量为27.1%。因而，黄鳍金枪鱼眼窝肉DHA的含量均高于以下几种淡水鱼类（如鲈鱼肌肉18.6%、鲢鱼肌肉4.0%和鳜鱼肌肉6.4%）；也明显高于以下几种海洋鱼类（如带鱼肌肉14.2%、鲳鱼肌肉9.7%和鲅鱼肌肉11.1%）[5]。所以黄鳍金枪鱼眼窝肉是重要的DHA源。

3 结论

超临界CO2法萃取金枪鱼油的优化工艺条件为萃取时间185.7 min，萃取温度57.8℃，萃取压力35.8 MPa，金枪鱼油萃取率为20.2%。GC/MS在本检测条件下对脂肪酸组成分析，具有操作简便，分离效果好，精密度较好的优点。外标法是气相色谱中一种比较理想的定量方法，它操作简单，计算方便，不需要校正因子。检测结果表明，眼窝油中DHA含量较高，为19.6 mg/g，证明眼窝肉是重要的DHA源。

[1]FIGIS.Fisheries Global Information System.FAO[EB/OL].http：//www.fao.org/figis.2006.

[2]Luis A V，Ernesto A，Angela A.Silage preparation from tuna fish wastes and its nutritional evaluation in broilers[J].Journal of the Science of Food and Agriculture，1999，79：1915-1922.

[3]藤田孝夫.高度不饱和脂肪酸と健康-水产食品と营养餐[M].东京：恒星社厚生阁刊，1981.

[4]范亚苇，邓泽元，余永红，等.不同脂肪酸甲酯化方法对共轭亚油酸分析的影响[J].中国油脂，2007，32（1）：52-55.

[5]倪培德.油脂加工技术[M].北京：化学工业出版社，2007.