三重RT-PCR快速检测多种马铃薯病毒的研究

陈阳婷 ，宁 红 ，张 敏

（1.成都农林科学院园艺研究所，四川 成都 610072；2.四川省植物检疫站，四川 成都 610041；3.四川农业大学，四川 雅安 625014）

快速诊断马铃薯病毒病是种薯品质鉴定的重要内容。在我国，主要的马铃薯病毒种类有马铃薯X病毒（Potato virus X，PVX），马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY），马铃薯卷叶病毒（Potato leaf roll virus，PLRV），马铃薯 A 病毒（Potato virus A，PVA）及马铃薯S病毒（Potato virus S，PVS）。对生产影响最大的病毒是PVY和PLRV，其次是PVX和PVA，PVS影响较小[1]。通过3 a田间调查及分子检测，发现在四川地区，PVX、PVS、PVA及PLRV往往复合侵染，迫切需要经济方便的多重检测方法。本研究设计了这4种病毒的引物，从退火温度、反转录反应中dNTPs浓度、PCR反应中Mg2+浓度、循环条件4方面优化反应条件。优化后的三重RT-PCR反应体系，可以同时检测田间复合侵染的3种马铃薯病毒。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从田间采集感染有马铃薯病毒的发病植株，以ELISA方法确定病毒种类，分别将PVX、PVS、PLRV和PVA混合接种于防虫温室内种植的健康马铃薯植株上，以植物组织培养室内经过茎尖脱毒的马铃薯组培苗作为阴性对照。

1.2 病毒RNA的提取

采用北京TIANGEN生化科技有限公司的RNAprep Plant Kit试剂盒提取带毒马铃薯植株的总RNA作为待测的病毒RNA。

1.3 cDNA的合成

根据 PVX、PVS、PVA以及 PLRV的基因组RNA保守序列设计特异性引物对（表1）。反转录体系（20 μL）：病毒总 RNA 2.5 μL，20 pmol/L 病毒下游引物各0.5 μL，5×MMLV buffer（MBI）4 μL，20 U/μL RNA 抑制剂 （Rnasin，MBI）0.5 μL，200 U/μL MMLV 反转录酶（MMLV RT，MBI）1 μL，dNTPs分别选用 0.5、1、1.5 mmol/L，DEPC 处理水补足 20 μL。反转录条件：42℃ 30 min，94℃ 5 min，4℃保存。扩增反应在eppendorf PCR扩增仪中进行。

表1 用于RT-PCR反应的4种马铃薯病毒引物对

1.4 PCR反应

RCR 体系（总体积 25 μL）：取 4 μL合成的cDNA 作为反应模板，10×PCR buffer（BioBRK）2.5 μL，5 u/μL Taq DNA 聚合酶 （BioBRK）0.5 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，MgCl2分 别 选 用 2.5、3、3.5 mmol/L，20 pmol/L 4种病毒上游引物和下游引物各1 μL，双蒸水补足 25 μL。退火温度从 57℃设到61℃；PCR反应条件是94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸 1 min，设置为 30 个循环、35 个循环、40个循环、45个循环，最后72℃延伸10 min；PCR反应在eppendorf PCR扩增仪中进行。PCR反应结束后，取出扩增产物5 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 三重RT-PCR的组合

三重 RT-PCR检测 PVX、PVS、PVA和 PLRV共有 4种组合方式，分别是：（1）PVX、PVS和 PVA；（2）PVX、PVS 和 PLRV；（3）PVX、PVA 和 PLRV；（4）PVS、PVA和PLRV。每一种组合的反应体系都从dNTPs浓度对反体转录的影响、退火温度对PCR的影响、Mg2+浓度对PCR的影响和反应程序对PCR的影响4个方面进行优化。

1.6 RT-PCR产物的克隆和测序

RT-PCR产物切胶回收后，按标准方法克隆到PGM-T中，PCR法筛选阳性菌落，提取质粒DNA，酶切验证后分别测序（上海英俊生物技术有限公司）。

2 结果与分析

2.1 反转录（RT）

反转录体系中dNTPs浓度为0.5、1、1.5 mmol/L时，对三重RT-PCR同时检测PVX、PVA和PLRV的影响如图1-A所示，当dNTPs小于1 mmol/L，PVA扩增靶带很弱；当dNTPs浓度为1～1.5 mmol/L时能扩增出PVX、PVA、PLRV这3种病毒的靶标条带；当dNTPs浓度为1.5 mmol/L时，扩增效果最好。三重RT-PCR同时检测PVS、PVA和PLRV的影响如图1-B所示，dNTPs浓度为0.5～1.5 mmol/L都能扩增出3种病毒条带。

图1 dNTPs浓度的优化

本试验采用的是两步法二重RT-PCR，首先反转录合成cDNA，然后取一部分cDNA进行PCR扩增。如果反转录没有合成cDNA或合成的较少，将直接影响到PCR扩增的效果，所以反转录反应相对较为重要[1]。可知，dNTPs浓度是影响反转录反应重要的因素。

2.2 聚合酶链式反应（PCR）

2.2.1 退火温度对PCR的影响 如图2-A所示，退火温度从58℃到62℃都能同时扩增出PVX、PVS、PLRV 3种病毒；从图2-B可知，当退火温度达到61℃时，三重RT-PCR仅能扩增出PVS和PVA两种病毒。当退火温度为60℃时，病毒的三条靶标条带清晰且亮度高，扩增效果最好。所以，退火温度对PCR也有一定的影响。

图2 退火温度的优化

2.2.2 Mg2+浓度对PCR的影响 PCR体系中Mg2+浓度为2.5、3.0、3.5 mmol/L时，对三重RT-PCR同时检测PVA、PVY和PLRV的影响如图3-A所示，当Mg2+浓度为2.5 mmol/L时，无法扩增出PVA，只能扩增出PVS和PLRV的靶标条带；当Mg2+浓度增为3 mmol/L，能同时扩增出PVS、PVA、PLRV 3种病毒的靶标条带；再继续增大Mg2+浓度，对3种病毒的扩增效果不好。如图3-B所示，Mg2+浓度为2.5、3.0、3.5 mmol/L 时，都能同时扩增出 PVX、PVS、PVA的靶标条带，当Mg2+浓度增为3 mmol/L，扩增效果最好。因此，Mg2+浓度对PCR扩增的影响较大。

图3 MgCl2浓度的优化

2.3 反应程序

如图4-A所示，PCR的循环数从30到45均能同时扩增出PVX、PVS和PVA，但是当循环数目小于30时，PVA的目的条带不明显；当循环数目大于40时，PVA的目的条带非常微弱；效果较好的是35个循环。从图4-B，可知PCR的循环数从30到45均能同时扩增出PVX、PVA和PLRV，扩增效果差异不大。总的来说，反应程序对整个反应影响不大。

图4 循环次数的优化

2.4 RT-PCR产物的克隆及测序

切胶回收 PVX、PVS、PVA和 PLRV的 RTPCR产物，克隆到PGM-T载体中，通过PCR验证得到的白色菌落分别含有以上几种病毒的cDNA，提取质粒测序。测序结果与NCBI BLAST报道的病毒基因序列对比，PLRV的RT-PCR扩增产物的序列与NCBI BLAST报道的相应病毒的序列同源性达到100%；PVA的RT-PCR扩增产物的序列与NCBI BLAST报道的PVA病毒的序列同源性达到99%；PVS的RT-PCR扩增产物的序列与NCBI BLAST报道的PVS病毒的序列同源性达到98%；PVX的RT-PCR扩增产物的序列与NCBI BLAST报道的PVX病毒的序列同源性达到96%。

3 讨论

传统的指示植物法检测病毒费时费力且灵敏度低，目前应用最广的是以病毒抗血清为基础的酶联免疫法（ELISA）检测病毒。ELISA法比传统的检测方法灵敏度提高了许多，但存在着假阳性或假阴性现象，也无法区分因外壳蛋白基因有一定同源性的病毒类型[2]，并且不足以检测含量极少的韧皮部病毒及休眠种薯中的病毒。近年来发展的反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法因其具有灵敏、快速、特异性强等优点，在植物病毒的检测上显示出强大的优势[3]。在国内外已有单一RT-PCR检测PVY、PLRV、PSTVd等的应用。

在RT-PCR中使用一对以上的引物就称之为多重RT-PCR，它能够同时扩增目的DNA中的几个片段，以节省模板、时间和减少费用。设置多重PCR反应体系必须确保反应中所有的引物有相近的熔解温度，扩增产物应该大小相近但又能够通过电泳分开。本研究设计的这4种病毒的引物，基本满足以上条件；并且从退火温度、dNTPs浓度、Mg2+浓度、循环条件4方面优化反应条件，将其应用于同时扩增3种病毒已成功实现。与单重RT-PCR相比，三重RT-PCR更适合于检测田间复合侵染的多种病毒，可以大大简化病毒检测的工作量，又能进一步降低成本，更有利于马铃薯种苗病毒实际检测，对于生产实践有着非常重要的意义。研究结果表明，采用该反应程序可以稳定性地检出田间自然感染的几种主要马铃薯病毒。并可以此研究结果为基础，对反应体系做进一步的优化，建立四重RTPCR同时检测多种马铃薯病毒的技术。

[1]袁 青，殷幼平，王中康.二重RT-PCR快速检测马铃薯病毒的方法[J].植物检疫，2005，19（3）：135-138.

[2]Jelkmann W,Keimkonrad R.An immuno-capture polymerase chain reaction and plate-trapped ELISA for the detection of apple stem spitting virus[J].Phytopathology,1997,145:499-504.

[3]李浩戈，吴元华，赵秀香.马铃薯Y病毒的RT-PCR检测[J].沈阳农业大学学报，1990；30（3）：244-246.