微流控芯片在表面等离子体共振生物传感器中的应用

骆亦奇

(斯坦福大学化学系 美国加利福尼亚94305)

今日化学

微流控芯片在表面等离子体共振生物传感器中的应用

骆亦奇

(斯坦福大学化学系 美国加利福尼亚94305)

作为众所周知的生物传感器技术，表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)正在被越来越普遍地用于实现各种生物化学检测方法，特别是用途广泛的固相表面生物检测(Solid－Phase Bioassay)。SPR对样品进行非标记检测，能够用于测量生物化学反应全过程的反应动力学。为了提高SPR的检测效率，通常将微流控技术(Microfluidics)与SPR相结合，即在SPR生物传感器中使用微流控芯片(Microfluidic Chip)作为反应装置。基于微型化带来的优势，使用微流控芯片作为反应装置可以有效地缩短生物化学检测方法的反应时间，并减少样品消耗。微流控芯片还可以平行排布相同的结构单元，提高SPR生物传感器的检测通量。因此，使用微流控芯片作为反应装置是SPR生物传感器，特别是商品化的SPR生物传感器的发展趋势。

1 表面等离子体共振生物传感器

表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)是当今应用最普遍的非标记光学生物传感器(Label－Free Optical Biosensor)技术，在生物和化学工业特别是制药工业中有很广泛的应用。SPR不需要对被测物进行标记的优点使其可以测量生物活性分子在无修饰条件下的反应动力学。因此，SPR适用于高通量生物活性分子特别是小分子的筛选，微量未知物的分析，以及在线样品检测。由于其广泛的应用价值，SPR生物传感器(SPR Biosensor)的商品化已有近20年的历史［1－3］。

SPR的工作原理是基于入射光激发的金属/电介质界面的电子集团性共振现象。SPR生物传感器中的电介质通常是含有生物活性分子的溶液。金(Au)是最普遍使用的金属材料，这不仅是因为金具有适合于SPR用途的物理性质，也由于金具有稳定的化学性质且易于进行表面功能化。金的表面可以通过自组装膜方法或者吸附方法固定生物活性分子，实现SPR生物传感器的生物分子识别和捕捉功能。在SPR生物传感器的测量装置中，p型偏振入射光被高折射率棱镜(Prism)耦合到金属膜(Metal Film)与溶液的界面上，入射光的能量在金属/溶液界面上被金属自由电子组成的等离子体(Plasmon)吸收。高折射率棱镜的作用是调节入射光的动量以达到与金属/溶液界面的模式匹配，使入射光能够共振激发金属自由电子的集团性震荡。等离子体的能量沿着金属/溶液界面向附近传播，以热能的形式消散，所以反射光的能量小于入射光的能量。在垂直于金属/溶液界面的方向上，等离子体的能量以消逝波(Evanescent Wave)的形式存在，通常这个消逝波的衰减距离在500nm以内。由于入射光和金属/溶液界面的耦合条件与消逝波范围内的溶液的折射率密切相关，可以用SPR测量金属/溶液界面邻近区域内的折射率。在实际应用中，通常用改变入射光角度的方法来改变到达金属/溶液界面的入射光动量。当入射光角度达到共振角时，入射光与等离子体达到最佳耦合条件，金属自由电子与入射光产生共振能量传递，入射光的能量几乎完全转换成等离子体的能量，反射光的能量达到最低。SPR光谱图就是反射光与入射光的相对强度(Reflectivity)对于入射光角度作图得到的曲线，从曲线的最低点可以读出共振角的数值。共振角的数值取决于金属/溶液界面邻近区域内的折射率，通过记录共振角随时间的变化，可以实时测量该区域内的折射率变化。对于SPR生物传感器来说，折射率变化由金属/溶液界面邻近区域内的生物化学反应引起，是衡量反应进程和反应动力学的有效指标。因为生物化学反应中的分子变化会引起反应所在区域的折射率变化，所以SPR生物传感器不要求对被检测的分子进行标记，有效地简化了样品制备过程。

SPR的测量装置可以通过两种带有棱镜的结构来实现，即按照棱镜－溶液－金属接触顺序的Otto结构和按照棱镜－金属－溶液接触顺序的Kretschmann结构。Otto结构中的溶液层厚度很小，给测量装置的制造增加了难度。因此，现在大部分SPR生物传感器尤其是商品化的SPR生物传感器的测量装置采用较易实现的Kretschmann结构。经典的采用Kretschmann结构的SPR生物传感器的测量装置如图1所示。理想的SPR光谱图如图2所示，从图2中SPR曲线的位置变化可以读出金属/溶液界面邻近区域内进行的生物化学反应引起的SPR信号变化。在实时测量反应进程时，SPR信号既可以是共振角的变化，也可以是在固定的入射光角度下测量由于共振角变化引起的反射光与入射光的相对强度变化。在SPR生物传感器的测量装置中进行的生物化学反应，可以用SPR传感器谱图(Sensorgram)即SPR信号关于时间的图谱来记录。

图1 采用K retschmann结构的SPR生物传感器的测量装置

图2 理想的SPR光谱图

生物化学检测方法中的固相表面生物检测(Solid－Phase Bioassay)是SPR生物传感器的主要应用方向。固相表面生物检测通过在固相表面上进行配体物(Ligand)分子与分析物(Analyte)分子的相互作用(Interaction)来实现。通常情况下这种相互作用是可逆的，包含了配体物分子与分析物分子的结合反应(Association)和解离反应(Dissociation)。固定在固相表面上的配体物分子可以识别并且结合与之接触的液相中的分析物分子，将液相中的分子有选择性地富集到固相表面上(图1)。同时，由于这种相互作用是可逆的，当液相中的分析物分子数量下降时，在固相表面上已经结合的配体物分子与分析物分子可以进行解离反应，使得分析物分子重新回到液相中。对于测量范围在金属/溶液界面邻近区域内的SPR来说，用于固相表面生物检测可以有效地发挥其长处，特别是不需要对被检测的分子进行标记的优点。因此，自从SPR生物传感器的概念提出以来，大部分SPR生物传感器，特别是商品化的SPR生物传感器用于实现固相表面生物检测。在学术界和工业界的应用中，SPR生物传感器已经可以通过固相表面生物检测来测量各种生物活性分子之间的亲和力，包括大分子与大分子之间的亲和力以及大分子与小分子之间的亲和力［4－7］。

在用于实现固相表面生物检测时，SPR生物传感器的测量装置需要执行3个主要反应步骤:①将可以选择性结合分析物分子的配体物分子固定在金属膜表面上。② 将流动的分析物溶液与金属膜表面接触，使得配体物分子与分析物分子在金属膜表面上进行相互作用，包括结合反应和解离反应。分析物是SPR生物传感器直接测量的物质，在常规的固相表面生物检测中，分析物溶液等同于样品溶液，分析物就是样品中的被测物。这个步骤可以称为结合步骤。③将流动的空白反应溶液(Running Buffer)与金属膜表面接触，使得在金属膜表面上的配体物分子与分析物分子进行解离反应。这个步骤可以称为解离步骤。在结合步骤中，开始时配体物分子与分析物分子只进行结合反应，随着金属膜表面上分析物分子数量增加，解离反应开始进行并且和结合反应同时存在，在反应时间充足的情况下，两者的速率逐渐趋于相等，相互作用接近动态平衡状态(Equilibrium)。在解离步骤中，由于空白反应溶液中没有分析物分子，理论上在解离反应进行的同时不会有结合反应发生。因此通过解离步骤的结果可以准确地得到解离反应的动力学参数，然后综合结合步骤和解离步骤的结果可以得到结合反应的动力学参数。理想的固相表面生物检测的SPR传感器谱图如图3所示，SPR信号的上升阶段显示了配体物分子与分析物分子的结合步骤，下降阶段显示了随后的解离步骤。SPR信号的变化幅度显示了金属/溶液界面邻近区域内总的分子数量变化，当配体物分子与分析物分子的相互作用达到平衡状态时，SPR信号的变化幅度可以用来计算分析物分子在样品溶液中的浓度。在主要反应步骤之外，测量装置也需要执行一些辅助反应步骤，包括在固定配体物分子之前活化金属膜表面和在固定配体物分子之后清洗金属膜表面。由于主要反应步骤所需的配体物、分析物和辅助反应步骤所需的物质以溶液的形式进入SPR生物传感器的测量装置进行各种反应，这些溶液可以称为用于固相表面生物检测的反应溶液。

SPR生物传感器技术在快速发展中。随着SPR测量方法的渐趋成熟，如何提高测量装置的效率成为革新的关键。SPR生物传感器的主要应用方向是高通量快速检测，微型化的测量装置是提高检测通量和速度的有效途径，理由是:①通常SPR生物传感器中的生物化学反应在流动中的溶液和功能化的金属膜表面上进行，所以测量装置的微型化可以提高传质效率，以此加快反应速率，同时提高检测速度［8－9］。②由于SPR的测量面积有限，测量装置的微型化可以增加单位面积上的反应器单元，提高SPR生物传感器的检测通量(Throughput)。③测量装置的微型化减少了检测所需的样品量，可以减少对微量样品的稀释程度，间接地改进SPR生物传感器的最低检测限(Limit of Detection)。所以，微型化的测量装置符合SPR生物传感器的要求并且从一开始就在其中应用。近年来，微流控技术(Microfluidics)的迅速发展提供了制造复杂的微流控芯片(Microfluidic Chip)的方法，推动了应用微流控芯片作为微型化的测量装置的SPR生物传感器的发展。

2 微流控技术和微流控芯片

微流控技术是研究设计制造微型化的实验装置(微流控芯片)并将其应用于以流体为载体的物理、化学、生物实验的学科。自从20世纪90年代初被提出以来，微流控技术已经成功地将大量传统的化学和生物实验工具实现在微流控芯片上［9－11］，例如高效液相色谱、生物活性材料合成、聚合酶链式反应、固相萃取、蛋白质结晶、单分子光谱等。作为传统实验工具实现微型化的平台，微流控芯片显示出了以下优势:高通量，快速，低样品消耗，体积小，一次性使用，以及易于实现自动化。微流控芯片的优势来自于微型化和液体在小尺度情况下的物理性质。微型化不仅缩小了实验装置的体积，减少了样品消耗，还拉近了各个功能单元的距离，便于将不同的实验工具在微流控芯片中连接起来实现自动化。同时，在微型通道里流动的液体，具有低Reynolds数流动的特点［12］。跟大尺度情况下相比，液体的流动受惯性力的影响下降，受黏滞力的影响上升。所以，液体在大部分微流控芯片中的流动类型属于层流，具有稳定的流场，可以较为准确地进行控制。

微流控芯片由一个或几个可供液体流动的微型通道网络(Microchannel Network)构成。微流控芯片中的通道可以按照所具备的功能划分为液体输送管道，反应器，控制器等结构单元。反应器是微流控芯片中实现各种反应的结构单元，里面带有功能化的表面或者参与反应的物质，例如用于SPR生物传感器的微流控芯片中金属膜所在的部分。控制器包括控制流体运动的阀门和各种推动流体运动的动力设备。微流控芯片中的阀门主要是微型薄膜阀［13］，动力部件包括微型蠕动泵(Peristaltic Pump)和电渗泵(Electroosmotic Pump)等［14］。

按照在垂直方向上的通道层数，可以把微流控芯片分为单层芯片和多层芯片。在单层芯片中，所有的通道排布于一个水平面上。单层芯片的优点是易于设计制造和稳定性高，缺点是无法安装位于微流控芯片内部的控制器。因此液体在单层芯片中流动的方向完全由外接设备提供的条件例如电场和外压力来控制，不易对特定位置的液流进行定点控制。在多层芯片中，通道排布于多个水平面上，在不同水平面上的通道之间既可以安装弹性材料的薄膜用于实现薄膜阀和蠕动泵等控制器［13］，又可以制造垂直的通道将不同平面上的通道连接成三维通道网络［15］。多层芯片的优点是可以在微流控芯片的内部使用控制器以实现复杂的功能，以及利用通道层数的优势提高单位体积内结构单元的数量;缺点是制造成本较高。液体在多层芯片中流动的方向可以由控制器和外接设备提供的条件共同来控制，易于对特定位置的液流进行定点控制。对于SPR生物传感器中的微流控芯片来说，也可以在垂直方向上将其分成流控部分(Fluidic Module)和基底部分(Substrate Module)。基底部分是带有金属膜的底板，用硬质材料制成，通常情况下金属膜是金膜是金膜(Gold Film)，底板材料是玻璃。流控部分则是除了基底部分之外的微流控芯片，包含所有的通道，其中与基底部分接触的通道是开放通道(Open Channel)，也就是有一个侧面敞开的通道。微流控芯片由流控部分和基底部分上下叠合起来组成，流控部分中的开放通道可以与基底部分形成侧面带有金属膜的封闭通道，SPR生物传感器测量的生物化学反应在这些通道内的金属膜表面上进行。

微流控芯片按照制造材料可以分为弹性材料芯片与非弹性材料芯片。弹性材料芯片主要以硅胶聚二甲基硅氧烷(PDMS)作为制造材料，主要原因为:①PDMS可以使用高复制度的多层软光刻模板印刷法(Multilayer Soft Lithography)进行加工并且具有生物相容性［13，16－17］;②PDMS是制造薄膜阀的理想材料，以PDMS作为制造材料的微流控芯片可以大规模地使用微型薄膜阀以及在其基础上构建的微型蠕动泵来实现对流体的控制。弹性材料芯片也可能会在弹性材料之外使用少量硬质材料，例如用于SPR测量的弹性材料芯片通常使用硬质材料制成的基底部分。另一方面，非弹性材料芯片通常以玻璃、石英、单晶硅、塑料等硬质材料作为主要制造材料，具有机械强度高的优点［18－20］。其中，玻璃和石英的表面电化学性质很稳定，是理想的用于毛细管电泳的微流控芯片材料［21］。单晶硅是制造集成电路的材料，以单晶硅为制造材料的微流控芯片可以与电子学技术结合以拓宽应用面［22］。以塑料为制造材料的微流控芯片可以用注塑加工来制造，价格便宜，适合工业化生产。非弹性材料芯片也可能会在硬质材料之外使用少量的弹性材料，例如具有液流控制功能的非弹性材料芯片经常使用PDMS薄膜构建微型薄膜阀［23］。因为弹性材料芯片和非弹性材料芯片各有优点，所以都有广泛的应用，也都被应用于SPR生物传感器中作为微型化的测量装置。

在大部分情况下，微流控芯片在应用时与合适的外接设备连接，由外接设备提供光源，电源，光电信号检测器，自动化机械装置，计算机等工具辅助微流控芯片完成其功能。流体运动的推动力也可以由气压源和微量注射泵等外接设备来提供。外接设备的应用是由于这些设备不能或者没有必要安装在微流控芯片上。对于SPR生物传感器来说，SPR光学系统不参与生物化学反应并且不需要微型化，因此可以作为外接设备与微流控芯片连接使用。通常情况下，商品化的SPR生物传感器的外接设备具有强大的功能，加入了载物平台和进样器等自动化机械装置以及计算机，用于实现SPR测量的自动化。因此，这种外接设备也可以称为SPR生物传感器的仪器系统。

3 微流控芯片在表面等离子体共振生物传感器中的应用

在微流控技术的支持下，商品化的和实验室报道的SPR生物传感器已经广泛使用微流控芯片作为微型化的测量装置以提高其检测效率。需要说明的是，大部分商品化的和一部分实验室报道的SPR生物传感器不是使用已经制成的微流控芯片，而是采用“实时组合”模式，在使用时将基底部分和流控部分组合成微流控芯片进行SPR测量。因为生物化学反应仅在基底部分的金属膜表面上进行，所以只有基底部分是SPR测量的耗材，流控部分可以重复使用。这种“实时组合”式的微流控芯片既降低了SPR测量的成本又有利于实现SPR生物传感器的自动化，所以被工业界广泛采用。在商品化的SPR生物传感器中，作为耗材的基底部分通常被称为传感器芯片(Sensor Chip)。如果不是从微流控芯片的角度而是从仪器结构的角度，也可以将商品化的SPR生物传感器分为光学单元，液体处理单元和传感器芯片，其中液体处理单元包括了微流控芯片的流控部分。传感器芯片的金属膜表面上可以进行化学修饰，其作用是协助生物化学反应在金属膜表面上进行。根据化学修饰的不同可以把传感器芯片分为各种类型，适用于不同条件下的固相表面生物检测。

对于SPR生物传感器的微流控芯片来说，设计的目标就是在实现这些反应步骤的同时提高SPR生物传感器的检测效率，包括SPR生物传感器的检测通量、精确度、最低检测限和检测速度等。

微流控芯片的微型化特点本身就可以改进SPR生物传感器的最低检测限和检测速度。SPR生物传感器的最低检测限与样品处理有关。当用于固相表面生物检测的样品量很有限的时候，如果用传统的较大尺度的测量装置，必须对样品溶液进行稀释以提供足够的样品溶液流过测量装置与金属膜表面接触。如果使用微流控芯片，在反应时间和样品溶液流速不变的条件下，可以降低样品溶液的稀释程度。这是由于微流控芯片中的溶液输送通道的截面积很小(通常在0.001～0.01mm2范围内)，样品溶液的流量也就是消耗量降低了。因此，微流控芯片可以通过减少对样品溶液的稀释来间接地改进SPR生物传感器的最低检测限。

当SPR生物传感器用于实现固相表面生物检测的时候，在金属/溶液界面上进行的结合反应和解离反应的反应动力学通常以Langmuir模型作为基础推理得出。根据Langmuir吸附等温式，反应动力学可以用方程(1)表示［24］。其中θ是分析物分子在金属膜表面上的覆盖率，即已经在金属膜表面上与配体物分子结合的分析物分子密度SA和分析物分子在金属膜表面上可能达到的最大密度之间的比值SA/(可以根据固定在金属膜表面上的总配体物分子密度乘以结合反应的化学计量数得到)，也可以用尚未与分析物分子结合的配体物分子密度SL和总配体物分子密度之间的关系式(－SL)/表示。是分析物分子在样品溶液中的浓度，是分析物分子在金属/溶液界面邻近区域内的浓度，在稳态时两者之间的关系可以用方程(2)表示［8］。造成与不同的原因是在金属/溶液界面上进行的结合反应属于非均相反应，只有在界面邻近区域内的分析物分子可以直接参与，反应器中其他的分析物分子必须通过传质过程进入界面邻近区域内才能参与结合反应。km是传质速率常数，用于衡量分析物分子在样品溶液中的传质速率。k1和k2分别是分析物分子与配体物分子结合反应和解离反应的反应速率常数。由方程(1)和(2)可以得到在金属膜表面上已经与分析物分子结合的配体物分子密度随时间变化的动力学方程(3)，显示出传质速率常数km对反应速率的影响。当传质速率常数km远大于结合反应速率常数k1时，也就是在高传质速率的情况下，反应速率与传质动力学基本无关，仅由反应动力学决定。但是，当传质速率常数km接近或者小于结合反应速率常数k1时，反应速率因为受到传质过程的限制会低于高传质速率的情况。由于传质速率常数km与反应器高度的三分之一次方成反比［8］，微流控芯片中的反应器具备的微型化特点有利于提高传质速率，减少传质过程对反应速率的限制。所以，微流控芯片可以加快固相表面生物检测中的结合反应和解离反应的反应速率，改进SPR生物传感器的检测速度。

微流控芯片的结构设计可以提高SPR生物传感器的检测通量和准确度。在SPR生物传感器中，微流控芯片的反应器是底面带有金属膜的通道。与液体输送管道相比，反应器通常具有不同的形状，但是有时候反应器也可以是液体输送管道的一部分。微流控芯片的设计重点在于如何排布液体输送管道、反应器、控制器等结构单元，使得固相表面生物检测所需的配体物分子和分析物分子被高效率地输送到反应器，在金属/溶液界面上进行相互作用。根据配体物分子和分析物分子被输送到反应器的方式，微流控芯片的设计可以分为连续输送型设计，交叉输送型设计和液体动力输送型设计等。

3.1 连续输送型设计

在连续输送型设计中，反应器处在一条液体输送管道当中，反应溶液通过这条液体输送管道流经反应器，配体物分子和分析物分子在反应器中的金属膜表面上进行相互作用。与液体输送管道相比，通常反应器是一个具有较大流动空间的通道。大部分连续输送型设计把一定数量的相同的反应器平行排布于微流控芯片中，使其能够同时进行多个结合反应，提高SPR生物传感器的检测通量。对于在这类微流控芯片中进行的固相表面生物检测来说，由于到达每一个反应器的配体物和分析物都来自同一条液体输送管道，如果不重复使用配体物或者分析物的话，相互作用的种类数NR与配体物的种类数NL及分析物的种类数NA之间应该是NR= NA=NL的关系。如果固相表面生物检测的步骤包括对金属膜表面上的配体物分子进行重活化(Regeneration)的步骤，分析物的种类数NA就可以不受限制，各种类数之间应该是NR=NA＞NL的关系。与其他设计相比，这种设计的优势在于反应器之间没有连接，反应溶液之间不易混合，保证了测量的准确度。具有代表性的连续输送型设计的微流控芯片包括以下几种。

1)美国Washington大学(Seattle)的研究人员报道的微流控芯片［25］。这种微流控芯片用一条液体输送管道连接了反应器和多个具有分离和混合等样品处理功能结构单元。因此，经过简单过滤的唾液样品可以直接进入微流控芯片，经过样品处理之后进入反应器，其中的分析物分子在反应器中的金膜表面上与配体物分子进行相互作用。这种微流控芯片实现了多种功能的集成化，有利于实现自动化的SPR生物传感器。

2)台湾成功大学和清华大学的研究人员报道的微流控芯片［26］。这种微流控芯片带有平行排布的液体输送管道和反应器，金膜位于反应器的底面上。微流控芯片中的薄膜阀可以控制液体的流动。配体物分子和分析物分子经过同一条液体输送管道进入每个反应器，在金膜表面上进行相互作用。除了用于反应器当中的金膜，这种微流控芯片还在靠近反应器的位置装有用于加热的金膜，可以有效地控制反应温度，提高SPR测量的准确度。

3)美国Utah大学的研究人员报道的“实时组合”式的微流控芯片，由流控部分和带有金膜的基底部分组成［27］。这种微流控芯片的流控部分带有垂直于金膜表面的液体输送管道，液流在其中的流动方向垂直于金膜表面，不同于大部分微流控芯片中液流平行于金属膜表面的设计。为实现这种设计，液体在液体输送管道的转弯处通过侧面的开口与金膜接触，液体输送管道的转弯处加上开口处的金膜可以被认为是反应器。在这种微流控芯片中，金膜位于反应器的侧面上，因此可以构建垂直于金膜表面的液体输送管道。配体物分子和分析物分子经过同一条液体输送管道进入每个反应器，在金膜表面进行相互作用。如图4所示，这种微流控芯片的结构类似于微孔板(Microplate)，液体输送管道的开口在侧面形成一个二维阵列，与金膜接触时可以形成一个反应器阵列。实现高通量的固相表面生物检测。液体输送管道垂直于金属膜表面有利于分析物分子的传质过程，使得分析物分子可以更快地进入金属/溶液界面邻近区域内，提高结合反应的反应速率。

4)通用电气公司(GE)属下的Biacore公司开发的Biacore 1000生物传感器中的“实时组合”式的微流控芯片，由作为流控部分的IFC(Integrated Microfluidic Cartridge)和作为基底部分的带有金膜的传感器芯片组成［1］。这种微流控芯片的流控部分带有平行排布的反应器，配体物分子和分析物分子经过同一条液体输送管道进入每个反应器，在反应器中的金膜表面上进行相互作用。液体的流动方向由薄膜阀控制。液体输送管道除了与反应器连接的部分，还包括定量环(Sample Loop)部分，因此可以在微流控芯片上准确地量取样品溶液。

5)日本产业技术综合研究所(AIST)的研究人员报道的微流控芯片［28］。这种微流控芯片的T形通道将两个金膜串联使用，在第一个金膜表面上进行配体物分子与分析物分子的结合反应，然后在第二个金膜表面上测量第一个金膜表面上的分析物分子催化的酶促反应进程。通过酶促反应进程可以间接地得到样品溶液中的分析物分子浓度，从而推测出样品溶液中的被测物分子浓度。由于SPR生物传感器测量的分析物不是样品中的被测物，这种检测属于间接型的固相表面生物检测。在这种微流控芯片中，两个金膜协同完成一种配体物和一种分析物的结合反应以及SPR测量。所以这种微流控芯片的设计可以算作对连续输送型设计的一种改进。

3.2 交叉输送型设计

在交叉输送型设计中，反应器处在两条液体输送管道的交叉点，反应溶液分别通过这两条液体输送管道流经反应器，配体物分子和分析物分子在反应器中的金属膜表面上进行相互作用。对于在这类微流控芯片中进行的固相表面生物检测来说，由于到达每一个反应器的配体物和分析物分别来自两条交叉的液体输送管道，如果不重复使用配体物或者分析物的话，相互作用的种类数NR与配体物的种类数NL及分析物的种类数NA之间有NR=NA×NL的关系。与连续输送型设计类似，如果固相表面生物检测的步骤包括对金属膜表面上的配体物分子进行重活化的步骤，分析物的种类数NA就可以不受限制，但是各种类数之间仍然是NR=NA×NL的关系。

交叉输送型设计的微流控芯片适用于高通量的交叉筛选，就是将几种配体物与几种分析物一对一地进行相互作用以筛选出具有反应活性的分析物。这是因为在交叉输送型设计中相互作用的种类数是配体物和分析物的种类数的乘积，既简化了反应溶液的输送又降低了反应溶液的消耗，对于交叉筛选具有最高的效率。具有代表性的交叉输送型设计的微流控芯片包括以下几种。

1)美国Wisconsin大学Madison分校的研究人员以及荷兰Twente大学的研究人员报道的“实时组合”式的微流控芯片，由流控部分和带有金膜的基底部分组成［29－31］。在使用过程中，流控部分在旋转90度之前和之后两次与基底部分组合，在水平方向上先后形成两组交叉的通道，分别用于输送配体物和分析物。配体物分子和分析物分子在位于两组通道交叉点的金膜表面上进行相互作用，交叉点位置上的通道和金膜可以认为是微流控芯片的反应器。这种设计也可以允许先后使用两种不同的流控部分输送配体物和分析物，例如使用带有多条平行通道的流控部分输送配体物和带有一条弯曲通道的流控部分输送分析物，输送分析物的通道与输送配体物的通道来回交叉，使得每一种分析物分子与配体物分子的相互作用都在位于不同通道交叉点的金膜表面上重复进行，以此提高SPR检测的精确度［30］。

2)美国Stanford大学研究人员报道的微流控芯片［32］。这种微流控芯片的流控部分使用弹性材料PDMS制造，制造方法遵循专门用于PDMS微流控芯片的多层软光刻模板印刷法，就是将带有开放通道的PDMS层加上基底部分按照顺序上下叠合形成带有多层通道的微流控芯片，如图5A所示。基底部分是带有圆形金膜的玻璃片。这种微流控芯片由两层通道组成，两层通道之间仅有几十微米厚度的PDMS薄膜作为间隔，在两层通道的交会处，这样的PDMS薄膜可以在压力作用下发生形变，作为薄膜阀使用。上层被称为控制层(Control Layer)，因为上层通道专门用来制造微流控芯片中的薄膜阀，以便在外接设备提供的压力下控制下层通道中液流的方向。下层被称为流动层(Flow Layer)，因为参与固相表面生物检测的反应溶液在下层通道中流动。流动层通道由两组交叉的液体输送管道阵列和位于交叉点的反应器组成，金膜位于反应器的底面上。配体物分子和分析物分子分别经过这两组液体输送管道进入反应器，在金膜表面上进行相互作用。这种微流控芯片可以同时在96个反应器中的金膜表面上进行配体物分子与分析物分子的相互作用，且每一种结合反应和解离反应都在4个相邻的金膜表面上重复进行，以此提高SPR测量的精确度。在使用这种微流控芯片时，推动控制层中的薄膜阀和流动层中的液流所需的气压由外接设备来提供。图5B展示了在使用过程中的微流控芯片以及微流控芯片的反应器区域在SPR生物传感器的光学系统中的成像。

图5 Stanford大学研究人员报道的微流控芯片

3)Bio－Rad公司开发的ProteOnTMXPR36生物传感器中的“实时组合”式的微流控芯片，由作为流控部分的MCM(Multichannel Module)和作为基底部分的带有金膜的传感器芯片组成［33］。这种微流控芯片的流控部分带有平行的开放通道，可以与传感器芯片组合形成在一个侧面上带有金属膜的封闭通道。流控部分固定在外接设备的机械平台上，能够自动旋转和升降，因此可以与基底部分自动进行组合。在使用过程中，流控部分在旋转90度之前和之后两次与传感器芯片进行组合，在同一个水平面上先后形成两组互相垂直的通道，可以分别用于输送配体物和分析物。配体物分子和分析物分子在位于两组通道交叉点的金膜表面上进行相互作用，交叉点位置上的通道和金膜可以认为是微流控芯片的反应器。如图6A所示，这种微流控芯片的流控部分带有6条平行排布的开放通道，与传感器芯片的两次组合能够产生36个阵列式排布的通道交叉点，所以可以同时在36个位于通道交叉点的金膜表面上进行配体物分子与分析物分子的相互作用。因为具有较高的检测通量，ProteOn XPR36生物传感器也称为阵列式蛋白质相互作用分析系统(Protein Interaction Array System)。此外，在输送分析物分子时，在交叉点两边没有配体物分子的金膜与交叉点的金膜与同一股液流接触且位置靠近，具备相近的反应条件，可以准确地提供SPR测量背景，提高SPR测量的准确度。相比于其他已报道的非自动控制的“实时组合”式的微流控芯片［29－31］，ProteOn XPR36生物传感器中的微流控芯片具有两个优势:①流控部分与基底部分的组合可以自动进行，既节省了固相表面生物检测所需的时间和工作量，又提高了多次使用时反应器位置的可重复性。②金膜表面上覆盖的聚糖类分子简化了固定配体物分子的反应步骤，避免了使用高浓度的有机溶剂对流控部分可能造成的损坏，因此固相表面生物检测的反应步骤都可以在微流控芯片中实现。这些特点使得微流控芯片的使用过程便于机械化控制。如图6B所示，微流控芯片可以在外接设备ProteOn XPR36仪器系统的辅助下实现ProteOn XPR36生物传感器的全面自动化，得到稳定且重复性高的SPR传感器谱图。

图6 Bio-Rad公司开发的ProteOn XPR36生物传感器中的微流控芯片

将微阵列生物芯片(Microarray Biochip)和微流控芯片结合也可达到交叉输送型设计的效果:①使用带有金膜的载体，通过点样技术将配体物固定在金膜表面上制成微阵列生物芯片。②将微阵列生物芯片作为基底部分与流控部分组合形成微流控芯片，金膜作为反应器的底面。这类微流控芯片通常采用“实时组合”模式，其中的反应器是一个具有较大流动空间的通道，也可称为流通池(Flow Cell)。分析物分子通过液体输送管道进入反应器，与配体物分子在金膜表面上进行相互作用。也就是说，配体物的输送在微流控芯片之外完成。这种设计的优点是可以将上百种配体物固定在金膜表面上，且配体物的位置不受微流控芯片中通道位置的限制，适用于要测量多种配体物的固相表面生物检测。但是，如果能够对金膜表面上的配体物分子进行重活化，就可以测量多种分析物，达到交叉输送型设计的效果。这种将微阵列生物芯片和微流控芯片结合的方法被用于Biacore公司开发的Flexchip，GenOptics公司开发的SPRi－Plex和SPRi－Lab+，Toyobo公司开发的MultiSPRinter，Graffinity Pharmaceuticals公司开发的Plasmon Imager，IBIS Technologies公司开发的 iSPR等商品化的 SPR生物传感器［1］，以及Washington大学(Seattle)的研究人员以及Alberta大学的研究人员报道的SPR生物传感器［34－35］。

3.3 流体动力输送型设计

在微流控芯片的微型通道里，液体流动的类型以层流为主。因此，在没有湍流的情况下，在微流控芯片中互相接触的平行液流不会混合，液流之间仅通过分子扩散来传质。根据这个特点，Washington大学(Seattle)的研究人员报道了用于测量小分子样品的微流控芯片［36－37］。这种微流控芯片可以在平行液流的分界线附近利用分子扩散进行被测物分子与分析物分子的相互作用，间接地改变分析物分子与配体物分子在金膜表面上进行的结合反应和解离反应进程，以此来测量被测物分子浓度。由于SPR生物传感器测量的分析物不是样品中的被测物，这种检测属于间接型固相表面生物检测。另一方面，在微流控芯片中也可以利用互相接触的平行液流之间的作用力来改变液流的流动空间，这种利用流体力学原理输送反应溶液的方式被称为流体动力配置(Hydrodynamic Addressing)。Biacore公司的研究人员使用流体动力配置型设计开发了“实时组合”式的微流控芯片，由作为流控部分的IFC和作为基底部分的传感器芯片组成［38］。这种类型的微流控芯片应用于Biacore S51和BiacoreA100生物传感器中。在这种微流控芯片中的反应器有两个进口和一个出口，固相表面生物检测所需的反应溶液与空白溶液分别从两个进口注入反应器，成为互相接触的平行液流。由于互相接触的平行液流会在有限容器中竞争流动空间，推动两种溶液运动的压强差决定了反应溶液在反应器中占有的流动空间，也决定了反应溶液在反应器底面上覆盖的面积。因为金膜阵列位于反应器底面上，所以通过压强差可以调节反应溶液覆盖的金膜的数量，使得各种配体物分子与分析物分子的相互作用可以在不同的金膜表面上进行。Biacore A100生物传感器中的微流控芯片拥有4个平行排布的分别带有5个金膜的反应器，可以同时在20个金属膜表面上进行配体物分子与分析物分子的相互作用。这种设计可以提高SPR测量的准确度，因为可以使用一个金膜为处于同一股液流之中的其他具备相近反应条件的金膜提供SPR测量背景。同时这种微流控芯片适合机械化控制，可以在外接设备BiacoreA100仪器系统的辅助下实现SPR生物传感器的全面自动化。

4 总结

与传统的用于固相表面生物检测的实验工具例如微孔板相比，SPR生物传感器显示出强大的优势:①不需要对分析物进行标记的特点既节约了标记用的试剂和反应步骤，又使得实时测量固相表面生物检测中的每一个反应步骤成为可能。②在固相表面生物检测的反应步骤中，分析物溶液或者空白反应溶液在反应器中流动更新，可以在结合反应中补充分析物分子的消耗或者在解离反应中维持没有分析物分子的溶液环境。与传统的不更新分析物溶液的实验工具相比，SPR生物传感器既提高了反应速率又方便了反应动力学计算。当使用微流控芯片作为测量装置时，SPR生物传感器可以在一小时内完成传统的实验工具需数小时才能完成的固相表面生物检测。随着微流控技术的发展，微流控芯片的设计在持续地改进，各种微流控芯片可以从不同的方面提高SPR生物传感器的检测效率，包括检测通量，精确度，最低检测限和检测速度等。对于SPR生物传感器来说，应用微流控芯片作为微型化的测量装置是将来的发展趋势。以在学术界和工业界广泛的应用前景作为推动力，这个研究领域将会继续发展。

本文对于SPR原理的介绍得到了俞枋博士(师从SPR权威Wolfgang Knoll教授)的帮助和指正，在此表示诚挚的谢意。

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