腺病毒载体携带HSV1-TK报告基因感染BMSCs后摄取131I-FIAU的实验研究

张斌青 吴 涛 孙 逊 安 锐

（华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，湖北省分子影像重点实验室 武汉 430022）

放射性核素报告基因显像技术在基因治疗领域的研究已取得长足进展[1–3]，但转基因干细胞进入活体后干细胞归巢、分化、功能表达以及外源基因表达部位和时间等研究较少。HSV1-TK/氟-碘阿糖呋喃基-尿嘧啶(2'-fluoro-2'-deoxy-1-β-Darabinofuranosyluracil, FIAU)是较成熟的放射性核素报告基因系统之一[2–4]。本研究利用携带报告基因(HSV1-TK)和治疗基因(BDNF)的重组腺病毒载体感染体外培养的BMSCs，研究重组腺病毒载体对BMSCs的增殖能力和诱导分化神经元细胞的影响，两目的基因表达的相关性分析，对放射性核素标记报告探针FIAU的摄取情况，为以后放射性核素报告基因活体监测转基因BMSCs治疗脑梗死奠定基础。

与胚胎干细胞和神经干细胞相比，BMSCs作为移植治疗脑梗死的供体细胞具有如下优点：取材方便，免疫反应弱，可在宿主神经系统中长期存活，且无胚胎干细胞移植治疗遇到的伦理学问题。其自我更新能力较强，是基因治疗理想靶细胞，因此转基因BMSCs成为细胞移植治疗的热点[6,7]。但对转基因干细胞的归巢数量、动态变化以及外源基因表达部位和时间，目前缺乏有效示踪手段。常用的活体示踪转基因干细胞技术，有光学成像、磁共振成像、放射性核素成像。光学成像的荧光光子穿透力较弱；磁共振成像的示踪灵敏度低，直接标记干细胞可能影响干细胞增殖和分化能力[8]。放射性核素报告基因示踪转基因干细胞将报告基因和治疗基因偶联，通过基因工程技术导入干细胞，用放射性核素标记探针显示体内报告基因的表达，以间接示踪干细胞和治疗基因的表达，具有无创伤和高灵敏的特点，为转基因干细胞活体示踪开辟了一条新的途径。放射性核素报告基因系统，可以酶为基础和受体，如 HSV1-TK[2–4]；或以转运体为基础，如多巴胺D2受体(D2R)、生长抑素受体(SSTR)及钠/碘转运体(NIS)[9]。以酶为报告基因的优点主要是酶的信号放大作用，此外酶报告基因多为外源性物质，避免了体内的非特异显像，其中HSV1-TK/FIAU是应用最多也是最成熟的报告基因系统之一。

1 实验材料和方法

1.1 材料

胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM-F12培养基，美国Gibco公司；FAU，美国Moravek生物公司；重组腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP及对照病毒Ad5-EGFP，上海鸣宏生物有限公司构建、包装、鉴定及滴度测定；Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP和Ad5-EGFP的 MOI分别为 2.0×1010PFU/mL 和3.6×1010PFU/mL；bFGF和EGF，美国Protein Tech公司；PCR引物，上海英骏生物技术有限公司合成；逆转录试剂盒，欧盟Ferments公司；Trizol、SYBR Green qPCR Super-Mix-UDG，美国Invitrogen公司；Iodogen (1,3,4,6,-1,3,4,6-tetrachloro-3alpha, 6-alphadiphenylglucoluril)、MTT、化学试剂，美国 Sigma公司；无载体无还原剂131I-NaI，北京原子高科公司；绿色荧光显微镜(TE 2000-U)，日本尼康公司；RQ-PCR仪，美国ABI公司(ABI1900)；Sep-Pak C18反相色谱层析柱，美国Waters公司；快速薄层层析-硅胶纸(TLC-SG)，上海仕元科学器材有限公司；γ计数器，合肥众成机电技术公司；正常SD大鼠，

华中科技大学同济医学院动物房提供。

1.2 方法

1.2.1 重组腺病毒感染体外培养的BMSCs

取2–4代BMSCs均匀接种于培养孔中，置于5% CO2、37℃培养箱培养，待细胞融合至80%时，对细胞换液，加入无血清培养基。计数孔内细胞，按病毒不同 MOI计算所需病毒体积，加入培养孔中，继续培养4 h，吸去上清，加入含15%胎牛血清的DMEM-F12，继续培养，备用。分别于24、36、48、72、96 h在荧光显微镜下观察感染重组腺病毒细胞的绿色荧光细胞阳性率，未感染病毒 BMSCs为阴性对照组。

1.2.2 MTT比色法检测感染BMSCs活力

不同MOI的重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNFEGFP感染BMSCs 48 h后，在各孔内同时滴加MTT溶液(5 g/L) 2×10–5L，37℃培养 4 h，弃上清，避光，每孔加入1.5×10–4L二甲基亚砜，振荡10 min，酶标仪上测量各孔490 nm吸光值A，计算BMSCs存活率=[A感染组/A阴性对照组]×l00%，绘制曲线。

1.2.3 感染BMSCs诱导分化

对重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP感染组和阴性对照组均加入终浓度为200 ng/L的bFGF和EGF，于5% CO2、37℃培养箱连续培养72 h，分别于6、12、24、36、48、72 h于倒置显微镜下观察，记录细胞生长及形态变化情况。

1.2.4 实时定量PCR

不同 MOI重组腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNFEGFP感染BMSCs，每组设三个复孔，以感染病毒Ad5-EGFP为对照组。感染48 h后加入适量Trizol，按操作说明书提取总RNA，cDNA合成按Ferments逆转录试剂盒说明书完成。QR-PCR反应体系为20µL，荧光定量PCR仪扩增40个循环，利用2－△△CT方法分析两目的基因的相对表达量(CT)。所用引物和扩增片段大小见表1。

表1 目的基因引物和扩增获得片段大小Table 1 The amplified fragments size and sequence of target gene primers.

1.2.5131I-FIAU的制备

放射性核素碘标记 FAU参照王瑞华等[5]采用的Indogen固相氧化法。以Sep-Pak C-18反相色谱层析柱对标记产物进行标记率分析。从131I-FIAU峰管取样点于 TLC-SG硅胶板，以乙酸乙酯:丙酮:水=14:8:1的混合液为展开剂进行层析，测定放射化学纯度。标记物在正常人血清和 PBS中 37℃下孵育4、12、24 h，分别取样测定放射化学纯度，评价标记物的稳定性。

1.2.6 细胞摄取

重组腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP感染BMSCs 48 h后进行细胞摄取实验，以对照腺病毒Ad5-EGFP为对照组。每组细胞随机分10个小组，每组设3个复孔，每孔加入纯化后的131I-FIAU 74 kBq，分别于 0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 h收集细胞，培养孔内的放射性培养基收集入试管，用0.1 mmol/L NaOH消化细胞后也收入相应的试管，测定培养液和细胞悬液的γ计数，摄取率=[C细胞悬液/(C细胞悬液+C细胞培养基)]×100%。

1.2.7 统计学分析

数据采用SPSS11.0统计软件处理，线性相关采用Pearson分析，两样本均数比较采用t检验，P<0.05为差异，有统计学意义。

2 结果

2.1 重组腺病毒对BMSCs的感染率及MTT检测细胞力

重组腺病毒感染BMSCs 24 h后在荧光显微镜下即可见绿色荧光细胞，随着时间延长，绿色荧光细胞阳性率有所增加，48 h时达峰值，且MOI为150时绿色荧光细胞阳性率>90%(图1)，72 h后荧光数量开始下降。在倒置显微镜下可见，各组感染细胞形态在观察时间内随着时间延长均无明显变化，MOI为250时仅可见极个别漂浮细胞，胎盘蓝染色证实为死亡细胞。MTT证实感染重组腺病毒BMSCs的增殖能力无明显影响，MOI为 150时BMSCS活力仍>98%(图 2)。

图1 MOI为150感染BMSCs 48 h绿色荧光显微镜下观察(×100)Fig.1 Green fluorescent protein expression in BMSCs after infected with recombinant adenovirus (MOI=150). (×100)

2.2 感染BMSCs诱导分化能力

重组腺病毒MOI为150时，感染Ad5-TK-IRESBDNF-EGFP组和阴性对照组经bFGF和EGF诱导分化， 6、12、24、36、48、72 h在倒置显微镜下观察细胞形态，发现诱导后36 h，部分细胞分化，胞体向核收缩呈梭形，有折光性，有较多的长突起，类似神经元细胞，72 h后可见大部分细胞呈神经元样改变，且两组无明显差别(图3)。

图2 感染重组腺病毒的BMSCs存活率曲线图Fig.2 Survival curve of BMSCs infected with recombinant adenovirus.

图3 诱导分化72 h后相差显微镜下观察A 阴性对照组; B 腺病毒感染组 (×200)Fig.3 Morphology under phase-contrast microscope 72 h after inducement A, the control; B, the Ad5-infected. (×200)

2.3 实时定量 PCR检测两目的基因表达及相关性分析

不同 MOI重组腺病毒感染 BMSCs后经QR-PCR证实均有目的基因TK和BDNF的表达，而对照组则无明显表达。经QR-PCR获得扩增曲线，利用 2－△△CT方法进行分析，计算CT，结果如图 4所示。各组感染细胞均有目的基因表达，且随着病毒MOI的增加而表达增加。数据经)Pearson相关分析，两目的基因的表达水平有良好相关性(r=0.973，P<0.05，n=3)。

图4 实时定量PCR检测目的基因的表达Fig.4 Expression of target gene detected with real-time PCR.

2.4 131I-FIAU制备结果

Sep-Pak C-18反相色谱层析柱对标记物经纯化后，可见两个计数峰，文献[5]已证实第一个峰的淋洗液经硅胶板薄层层析表明其Rf值为0.3，与无载体无还原剂131I-NaI经相同的展开系统进行TLC-SG得到相同的结果，证明此峰是131I峰；第二个峰的淋洗液经TLC-SG表明Rf值为0.7–0.9，证明是标记产物131I-FIAU。经测定，标记率为(64.35±4.89)% (n=5)；TLC-SG硅胶板层析法测定，131I-FIAU的放射化学纯度为(98.62±0.62)% (n=5)。131I-FIAU在正常人血清和PBS中37℃中孵育24 h后，放射化学纯度仍>95%。

2.5 重组腺病毒感染BMSCs后对131I-FIAU的摄取研究

MOI为150时感染BMSCs。由图5，3 h内感染目的基因细胞对131I-FIAU的摄取程度与时间呈正相关，3 h时的131I-FIAU摄取率达(31.42± 0.46)%(n=3)，此后增加不明显。各时间点的感染目的基因细胞摄取率均显著高于对照组(t=23.06–173.83，P<0.05，n=3)。

图5 腺病毒感染BMSCs后对131I-FIAU的摄取率Fig.5 131I-FIAU uptake in BMSCs infectedby recombinant adenovirus.

3 讨论

将两个目的基因偶联的常用技术主要有融合基因、双启动子及IRES技术，本研究将IRES作为两目的基因的链接工具，其优点在于上下游基因共用一个启动子，上游基因的表达可间接反映下游基因的表达，二者具有良好的相关性；此外 IRES翻译出的蛋白具备各自的空间构象，与融合基因相比避免了蛋白空间折叠可能引起的功能障碍。本研究证明，IRES介导的两目的基因可同时表达，随着病毒MOI的增加而表达增加，mRNA的表达量有良好的线性相关，上游基因的表达可间接反映下游基因的表达，由此可以推断，在体内亦可通过报告基因的表达数量和数部位来间接反映治疗基因的数量和部位，对治疗基因进行定量分析和示踪。

理想的报告基因载体转染干细胞应该不仅能携带较多的碱基，而且在体外可获得较高的感染滴度，感染后不影响干细胞的增殖和分化功能。现在常用基因携带载体主要有病毒载体和非病毒载体，病毒载体主要有腺病毒载体和逆转录病毒载体，而逆转录病毒的碱基容纳较少，体外获得到的感染滴度较低；非病毒载体应用较多的是质粒载体，质粒载体对干细胞的转染率较低且毒性较高；因此本研究采用的是重组腺病毒载体，本研究结果表明重组腺病毒载体在携带较多碱基时仍能在体外获得高感染滴度，MOI为 150时对 BMSCs的感染效率可大于90%，同时通过倒置显微镜形态观察和MTT比色法检测均证实重组腺病毒对 BMSCs的增殖能力不受影响；诱导神经元细胞分化实验也表明，感染了重组腺病毒Ad5-TK-IRES-BDNF-EGFP的BMSCs仍保持良好的诱导分化神经元细胞功能。

HSV1-TK报告基因系统的各种底物中，FAU通过扩散方式进入细胞内，如细胞内存在 HSV1-TK，FAU被磷酸化滞留于细胞内，可以通过体外探测技术在活体上检测到转基因细胞的动态变化，而无磷酸化的FAU则很快排除细胞，随着泌尿系统的分泌排泄，组织和血液中的FAU水平下降，具有较高的灵敏度和特异性[1,5]。本实验室前期研究证实采用Idogen固相氧化法对FAU进行射性碘标记是一种简单的标记方法，经过Sep-Pak C18反相色谱柱，可以得到较高放射化学纯度[5]。本研究结果表明携带 HSV1-TK报告基因的重组腺病毒感染BMSCs后，对131I-FIAU有较强摄取，在观察时间内，随着时间延长摄取率升高，感染组摄取率明显高于对照组摄取率，二者差异有统计学意义，提示携带报告基因TK的重组腺病毒载体感染BMSCs，可以表达有活性的酶，将131I-FIAU磷酸化而滞留于细胞，提示HSV1-TK/FIAU报告基因系统可用于活体动态示踪干细胞移植治疗脑梗死。

综上所述，重组腺病毒 Ad5-TK-IRES-BDNFEGFP可高效感染 BMSCs，IRES介导的两目的基因可同时表达且有良好线性相关，感染 BMSCs仍保持良好的增殖和诱导分化神经元细胞能力，并且能表达具有活性的激酶，使131I-FIAU磷酸化并有效滞留在细胞内用于体外探测，这为活体报告基因显像示踪转基因 BMSCS治疗脑梗死奠定了实验基础。

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